今天跟大家分享的是发表在Cell Chemical Biology上的文章“Cyclization Reaction-Based Turn-on Probe for Covalent Labeling of Target Proteins”。文章通讯作者是Toshimasa Itoh。本篇文章作者设计了一种基于环化反应的荧光探针，该探针可与多种氨基酸反应，其荧光的产生依赖于蛋白-配体的结合。作者首先预试炔酮是否会和亲核性氨基酸反应。通过模型蛋白PPARγ和包含炔酮结构的脂肪酸衍生物27反应，发现化合物27结合于PPARγ配体结合域的Cys285位点。基于上述结论，作者设计了环化探针1。该探针包含与目标蛋白亲核试剂反应的壬酸酯，羟基和酯通过内酯化反应形成7-甲氧基香豆素（7-MC）的荧光基团。与其他荧光基团相比，香豆素的荧光性质和溶解度可以通过改变取代基进行调整。此外，由于香豆素体积小，对蛋白质功能的影响也较小。
作者检测了环化探针1与不同氨基酸（结构保护）的反应活性。其中，Cys, Lys, His, Tyr, Trp可以和TCC探针形成结合产物，但是产量低。而Ser, Thr, Arg, Asp,Glu, Asn, Gln不反应。低反应效率同时降低了非特异性反应的发生。
作者继续评估化合物2-6的光物理性质。选择甲苯，四氢呋喃（THF），MeOH和H2O四种溶液，分别对应非极性，中极性和极性溶剂。化合物2-6显示的吸收最大值，发射最大值和产率均不同于7-MC。发射最大值按照3 <5 <7-MC <4 <2 <6的顺序显著红移，且在所有溶剂中排序相似。其中化合物2和6具有很高的荧光强度，3、4、5荧光强度较弱。另外，大多数合成化合物的产率与溶剂密切相关，一般在非极性溶剂中产率更高，因此可以通过环化探针特征发射光谱和产率来预测蛋白-配体结合位点附近的溶剂微环境。作者通过反应监测探针1与Cys在THF中发射光谱随时间的变化来测试TCC探针的活性，发现发射光谱的强度随时间（0.5–10 h）急剧增加，表明TCC探针确实是通过亲核试剂的共轭加成驱动关闭/开启荧光探针。
作者选择VDR靶蛋白与TCC探针进行体外标记。VDR是核受体家族的成员，与1,25D3结合后，在钙代谢，免疫调节和细胞分化中起重要作用。基于VDR-LCA的晶体结构，作者设计了基于VDR配体的LCA-TCC探针，并优化了linker的长度。通过MS分析在加入化合物7-11后，有 VDR-7-MC 共轭产物生成，其中化合物9的反应活性最高。化合物9形成的共轭产物最大吸收波长为324 nm，最大发射波长为398 nm。同时，荧光强度随着时间延长而增高，当加入1,25D3后产物生成会受到竞争性抑制。
为了提高探针的荧光强度，作者在香豆素7号位上引入给电子基团。与预期相符，二烷基氨基取代甲氧基后使吸光度最大值和发射光最大值均向长波长方向移动并增强了荧光强度。
作者基于优化后的结构设计了 LCA-TCC探针21和22。但是探针22由于光敏感性无法进行纯化，且对VDR的标记效率远低于21。作者通过X射线晶体学分析得出VDR与21的主要结合位点是 His140。标记后的VDR经凝胶成像分析表明，探针21的反应活性高于22，且在无VDR组中没有荧光产生，说明荧光的发生依赖蛋白-配体的结合。综上，探针21具有高反应活性、高选择性、荧光强度高的特点，且能运用于活细胞标记。
撰写人：王念
DOI：10.1016/j.chembiol.2020.06.016
原文链接：https://www.cell.com/cell-chemical-biology/fulltext/S2451-9456(20)30006-4
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