为大家推荐一篇发表在Cell Chem.Biol.上的文章：Cyclization Reaction-Based Turn-on Probe for Covalent Labeling of Target Proteins，文章的通讯作者是来自日本昭和药科大学的伊藤俊将教授。

 用荧光分子对蛋白质进行化学修饰可以用于鉴定复杂样品中的蛋白质，也能用于研究体外或体内特定的生物学事件，是蛋白质组学和基础分子生物学研究的重要工具。除了传统的基于蛋白质或者肽标签的方法外，最近广泛研究了用于蛋白质标记的生物正交反应并将其应用于目标分子的标记。但是，大多数标记方法都需要反复洗涤以减少背景噪音，克服这种局限性的一种方法是Turn-on型荧光探针，当探针与预期的靶标反应时，荧光强度会增加，从而能够以高的信噪比进行选择性检测。目前已经开发了许多Turn-on型荧光探针用于检测活性氧、金属离子和酶的活性，但是只有少数探针可用于检测非酶蛋白。

 作者希望开发一种能与多种亲核试剂反应的Turn-on型小分子荧光探针（TCC），这一探针设计思路的关键一步是共轭加成，因此，作者首先研究了炔酮类化合物是否能与目标蛋白中的亲核氨基酸发生共轭加成反应。作者使用PPARγ作为模型蛋白，这一蛋白可用于治疗II型糖尿病。对PPARγ配体结合域（LBD）和炔酮类化合物结合的ESI-MS和X射线晶体分析表明，PPARγ中的Cys285与配体发生共价结合。作者因而设计了一个含有炔酸酯结构的Turn-on型探针（TCC probe），该探针由特异性识别靶蛋白的配体、作为Turn-on荧光基团的炔酸酯前体、连接这两个模块的聚乙二醇linker三部分组成。标记时，配体先与靶蛋白结合，然后前体模块中的炔酸酯通过邻近效应与位于蛋白表面的氨基酸残基反应，共轭加成产生烯醇酸酯，随后内酯化脱去配体形成7-甲氧香豆素荧光基团。

 作者首先测试了TCC与不同氨基酸的反应，发现在近似生理条件下Cys、Lys、His、Tyr和Trp的侧链能与TCC形成加合物，说明TCC可以标记靶蛋白上的多种氨基酸。作者又测试了这5种TCC-氨基酸加合物在不同极性溶剂中的光学性质，发现在不同溶剂中这些化合物的发射峰分布顺序一致，但量子产率明显不同，这种量子产率对极性的敏感性使得TCC探针可用于预测蛋白质配体结合位点并了解其局部环境。

 作者在VDR上测试了TCC的标记能力，VDR是核受体超家族的成员，在钙代谢、免疫调节和细胞分化中起重要作用。根据VDR-石胆酸（LCA）配合物的晶体结构，作者设计了包含LCA结构的VDR TCC，并将大鼠的VDR-LBD与LCA-TCC共孵育，通过ESI-MS分析标记反应。Apo VDR与非共价配体

1, 25D3孵育不会影响质谱上的质量峰；相反，在TCC的存在下，新的质量峰与预期的共轭加合物一致，在低分子量区域中也检测到消除的配体相对应的峰。这些结果表明VDR被7-MC共价修饰。在1,25D3的竞争下，TCC标记被完全抑制，表明标记反应需要LCA探针与配体结合口袋的特异性结合。作者又用荧光光谱对标记反应进行了表征，TCC与VDR-LBD结合后荧光强度显著增强，而1,25D3的竞争则会使荧光增强的现象消失。此外，被香豆素基团标记后的配体结合口袋保留了活性，仍然可以与其他配体结合。

    作者接下来对探针的结构进行了调整以优化其荧光性质，用二乙基氨基和二环己基氨基取代甲氧基得到了改良后的TCC。作者用SDS-PAGE分析了优化TCC标记的VDR，发现即使在大肠杆菌裂解液的存在下，TCC也选择性标记VDR，若无VDR则在相同条件下不会发生标记；用1,25D3进行预处理可完全抑制荧光标记证明探针的确是Turn-on型的，且具有特异性。作者随后用TCC成功标记了PPARγ。

   为了拓展TCC的应用，作者尝试用肽段代替简单配体来完成标记。ESI-MS表明，肽修饰的TCC仍然可以对VDR和PPARγ进行香豆素化标记，且这种标记会被竞争性肽段竞争掉；在能够导致靶蛋白构象改变的激活剂存在下，标记亦被抑制，说明探针对靶蛋白的构象变化非常敏感。用肽段成功标记了VDR和PPARγ，意味着这一类肽探针可能在蛋白质组学研究中用于鉴定新的相互作用伴侣蛋白。

   综上，作者开发了一种基于共轭加成的Turn-on型香豆素类荧光探针，具有易合成、可标记多种氨基酸、对被标记物活性影响小的优点；但标记可能是不可逆的，且反应性和选择性有待提高。这一类Turn-on型小分子探针可以用于多种蛋白质的标记，在蛋白质组学和药物的发现中有一定应用价值。

本文作者：TZY

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2020.01.006

文章引用：DOI：10.1016/j.chembiol.2020.01.006