大家好，本次跟大家分享的文章是发表在Cell Chemical Biology上的文章，文章的题目是Photoaffinity Labeling and Quantitative Chemical Proteomics IdentifyLXRβ as the Functional Target of Enhancers of Astrocytic apoE. DOI:10.1016/j.chembiol.2020.09.002。文章的通讯作者是美国坎布里奇辉瑞全球研发中心的Uthpala Seneviratne和Martin Pettersson教授。

载脂蛋白E（apoE）是一种参与胆固醇的反向转运的重要脂质转运蛋白。在大脑中，apoE在神经元生长和修复、突触发生、神经免疫调节和清除淀粉样蛋白β(Aβ)中发挥关键作用。在中枢神经系统中，星形胶质细胞是分泌apoE的原代细胞，其次是小胶质细胞。人类有三种常见的apoE亚型，apoE2、apoE3和apoE4，它们仅在氨基酸位置112和158有所不同:Cys112和Cys158（apoE2）、Cys112和Arg158（apoE3）、Arg112和Arg158（apoE4）。这些小的氨基酸差异对apoE的结构、表达、与低密度脂蛋白受体等结合以及促进神经突生长的能力等功能都有很大的影响。因此，识别调节apoE的小分子对于深入了解apoE相关疾病的生物学前景和治疗至关重要。在这篇文章中，作者设计了一种表型筛选策略来识别人类星形胶质细胞分泌apoE的小分子激活因子。

为了进行表型筛选确定apoE分泌调节因子，作者以CCF-STTG1细胞为细胞模型，将脂化后的apoE加到培养基中。在384孔板中进行了一次大规模的化学多样性筛选，其中包含47.8万种化合物，浓度为10 mM。经过48小时的复合处理后，使用AlphaLISA技术和一系列的评价方法从筛选出800个化合物进行下游二次分析。紧接着通过监测确认的白细胞介素（IL）-1b活性，通过影响总分泌机制，刺激CCF-STTG1细胞的IL-6分泌，以清除增加apoE分泌的化合物。并且还监测了apoE mRNA和apoE脂化基因（ABCA1和ABCG1）在CCF-STTG1中的mRNA水平。最后，作者还评估了关键化合物对人初级星形胶质细胞分泌apoE的影响（图1A）。在此基础上，作者选择了一个含有吡咯烷的化合物作为该文章中描述的化学物质的起始点（图1B）。

紧接着作者就设计了光亲和探针来鉴定apoE增强子的蛋白靶点。在之前所筛选出来的含有吡咯烷的化合物1的基础上合成了探针2，探针结构中的二甲苯酮结构和炔基分别进行光交联反应共价连接蛋白和点击化学反应连接生物素或者荧光团（图2A）。从SDS-PAGE的结果可以看到当探针浓度为500 nM时有明显的标记条带，并且化合物1能和探针产生明显的竞争标记效果（图2C）。作者采用SDS-PAGE实验筛选出的标记条件进行蛋白鉴定实验。作者通过竞争标记并且结合SILAC定量方法来对CCF-STTG1星形细胞瘤细胞蛋白组中标记富集到的蛋白进行定量分析（图2B）。虽然鉴定了700多个蛋白质，但定量结果显示只有一个肝脏x受体β（LXRβ, NR1H2）H/L>4，显示出与化合物1强有力的竞争。作者从CCF-STTG1星形细胞瘤细胞中获得的定量化学蛋白质组学数据确定了光探针2的靶标是氧甾醇受体LXRβ。

为了进一步确认内源性条件下的光探针2标记的LXRβ，作者还对探针标记的CCF细胞进行了LXRβ的Western blot实验（图3A、3B）。实验结果可以看出有明显的条带并且与SDS-PAGE的荧光条带相一致（图3C）。同时随着化合物1浓度的增大，条带颜色也逐渐变浅，表明化合物1对光探针2标记LXRβ产生明显的竞争效果（图3D）。为了证明化合物1与LXRβ的直接靶标结合，作者还进行了细胞热位移试验（CETSA）。CETSA可以检测配体诱导的蛋白热稳定性的变化，这表明配体与细胞中的蛋白靶标结合。CETSA实验进一步证实了化合物1直接与LXRβ结合并经历构象变化来增加热稳定性。

最后作者又确定了光探针2对LXRβ的标记位点。根据MS/MS片段模式预测光标记位点在丝氨酸278或缬氨酸279上的可能性很高（图4）。为了进一步探究配体结合位点，作者又建模光探针2结合LXRβ的晶体结构，发现苯甲酮羰基与Ser278形成氢键，突出了二苯甲酮羰基双自由基之间的邻近性，表现出与Ser278发生了光交联，而Val279则指向别的方位（图4 D）。这些发现证明了化学蛋白质组学不仅有助于目标识别，而且可以绘制药物靶点的结合位点。

总结，该文作者基于吡咯烷类先导化合物设计了一种可进行点击化学的光亲和探针，并在人星形细胞瘤CCF-STTG1细胞中进行了基于探针的定量化学蛋白质组学，并鉴定出靶标LXRβ。细胞热位移实验(CETSA)表明小分子配体的结合稳定了LXRβ。此外，作者通过质谱鉴定了一种探针修饰的肽，并提出了一种光亲和探针结合在LXRβ配体结合袋中的模型。该文的结果强调了化学蛋白质组学方法识别表型筛选命中目标的能力。此外，该文描述的LXRβ光亲和探针和先导化合物可作为进一步评价LXRβ途径的有价值工具。