为大家介绍一篇发表在Chemical Science上的文章，题目为Transcriptome-wide profiling of N6-methyladenosine via a selective chemical labeling method。本文的通讯作者是来自武汉大学化学与分子科学学院的周翔教授，致力于核酸化学生物学的相关研究。
对RNA修饰的研究推进了表观转录组学的深入理解。N6-甲基腺苷（m6A）是最典型的RNA修饰，在生物学过程中广泛存在。本文中作者提出了一种“化学pulldown法”（m6A-ORL-Seq）用于m6A转录组分析。与此同时，化学标记会产生特定的逆转录（RT）截短产物。该方法在人类转录组中以单碱基分辨率鉴定了4000个精准的m6A位点。与先前报道的通过m6A抗体或m6A响应的酶的检测方法不同，无抗体/无酶的化学方法为转录组水平的单碱基m6A检测提供了更加可信的新策略。迄今为止，已经有超过163种化学修饰在RNA上被发现，这些修饰含有不同官能团，并通过多种途径对基因表达进行调控。其中，m6A是真核生物信使RNA（mRNA）和非编码RNA转录后修饰中最广泛的。m6A被证明是mRNA剪接、运输、翻译和结构组成的主要调控方式。此外，m6A的异常修饰水平也和肿瘤的发展息息相关。因此，更加深入地理解m6A的生物学功能需要更加准确的检测和定位手段。在之前的工作中，研究者通过m6A特异性抗体和RNA测序技术结合，获得了哺乳动物RNA中m6A富集在3’非翻译区和终止子附近的结果。但这种方法分辨率低，易出现假阳性结果。因此，抗体依赖型的或酶依赖型的新检测方法应运而生。其中，基于抗体免疫沉淀偶联的方法提高了分辨率，基于酶的方法同样提高了分辨率，同时可以进行定量分析。之后，三代测序技术（单分子实时测序和纳米孔测序等）实现了m6A的长序列读取和单分子测序。然而，酶依赖的方法因序列偏差和RNA结构因素同样导致了测序中假阳性结果的产生。此外，单碱基分辨率的m6A测序技术同样因引入的CCACAG基序可以影响m6A响应的内切酶活性，导致产生了广泛的假阳性结果。因此，新的m6A测序技术将对表观遗传修饰的研究提供更加准确的分析结果。由于m6A中甲基的惰性，m6A和A的化学鉴别对化学家来说是一个巨大的挑战。本文中，作者报道了一种新的化学方法，通过三个化学反应步骤（氧化、还原、功能标记，简称为ORL）对m6A进行选择性标记，并通过生物素-链霉亲和素正交亲和的方法对转录组进行区域分析（图1）。本文中，作者首先使用一氧化氮（NO）水溶液对m6A腺嘌呤N6位氨基进行反应，使m6A在温和条件下的发生N-亚硝化（4℃，乙酸钠缓冲液，pH 4.5），生成Nm6A。虽然NO在有氧条件下也具备其他碱基的脱氨能力，如可以将腺苷转化为肌苷（A→I），鸟苷转化为黄苷（G→X），胞苷转化为尿苷（C→U）。然而在作者筛选出的最优条件下（4℃, 30 h），A→I的转化率为31%，G→X的转化率为56%，C→U的转化率为9.8%，而m6A转化为Nm6A则具有最高转化率（88%），该条件下反应可行。接下来，作者筛选出了绿色还原剂硫脲二氧化物（TDO），在Na2CO3/NaHCO3中将Nm6A还原成N6-NH2 m6A(Am6A，HPLC产率：60%)和m6A。然后，作者使用2-吡啶甲醛测试与Am6A中氨基的缩合反应性，Am6A在没有任何催化剂的情况下有效地转化为腙。因此，作者成功通过该方法在m6A位点引入功能性探针，获得Bm6A（生物素-m6A偶联物，图2）。图2. m6A-ORL中亚硝化反应的优化、还原反应及生物素化芳香醛结构接下来，作者对上述化学法在寡核苷酸链上的可行性进行了验证。首先作者合成了仅含有U和m6A的12 nt RNA寡核苷酸序列（12nt-m6A）。随后作者将该序列加入到一氧化氮鼓泡的酸性缓冲溶液中，通过HPLC检测到12nt-m6A定量转化为Nm6A(12nt-Nm6A)。之后，将12nt-Nm6A在加热和碱性条件下通过TDO还原转化为12nt-Am6A，产率为46%。12nt-Am6A经与BA共同反应并HPLC纯化后，几乎90%的12nt-Am6A转化为生物素化探针产物（12nt-Bm6A）。同时，作者将该方法在另一种含有A/U/G/C/m6A（15nt-m6A）的15 nt RNA寡核苷酸上进行验证。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析表明几乎50%的15nt-m6A转化为生物素化产物。此外，作者通过液相-质谱联用法分析了每个化学孵育步骤后修饰的寡核苷酸被酶促消化反应的结果，同样证实了每步化学反应的成功发生，即对应修饰的成功生成（图3 A和B）。
在将该方法应用于m6A的转录组分析之前，作者进行了体外水平的验证。首先，作者通过控制NO鼓泡时间和孵育时间来研究N-亚硝化的最佳条件。变性PAGE分析和RNA定量实验证实，最优的N-亚硝化和TDO还原条件不会引起大量的RNA降解。随后，作者从HEK-293T细胞中提取总RNA，并片段化为60–200 nt，然后进行N-亚硝化。反应后将RNA消化成核糖核苷，并使用LC-MS/MS分析和定量。最终作者确定了20小时作为最佳孵育时间，此时Nm6A/I的比例最高（避免A的过度突变），同时又保证了足够的Nm6A浓度（高标记效率）。作为模型验证，作者将m6A-ORL用于m6A修饰的60-nt模型RNA（MALAT1-2577-m6A）。在化学标记和纯化后，斑点杂交法证明了模型RNA中m6A成功被生物素化。同时，将标记的模型RNA与酵母tRNA混合并用pulldown实验进行富集，之后将富集的RNA进行RNA测序。测序结果表明，标记的m6A绝大部分被读取为A，此外还包含了A到G的主要突变（6.8%）。斑点杂交分析进一步证实了m6A-ORL能够选择性标记HEK-293T总RNA中的m6A位点。因此，m6A-ORL有望用于m6A的转录组广谱分析（图3 C和D）。
图3. m6A-ORL法对RNA标记的体外可行性验证接下来，作者在细胞水平上对m6A-ORL法的标记能力进行了验证。首先作者对HEK-293T中m6A的转录组部分进行m6A-ORL实验。作者从HEK-293T细胞中提取的30 μg总RNA（m6A-ORL1，掺有0.01%含m6A的对照RNA）或5.0 μg poly(A)+ RNA（m6A-ORL2，掺有0.01%含m6A的对照RNA）,并分别进行m6A-ORL反应，最后进行高通量测序。测序结果计数证实了m6A-ORL能够富集m6A片段。此外，作者在包含典型m6A DRACH基序的人转录组中鉴定出大量的m6A。另一方面，作者也通过m6A-ORL-Seq在已证实的m6A高频区域（MALAT1，ACTB）检测到了m6A。作者通过平均归一化读数分析m6A分布，进一步证明了m6A-ORL的精度。作者对五个非重叠转录物区段中m6A含量进行比对，绘制的饼状图结果与先前报道的m6A分布一致。此外，作者对比了m6A-ORL-Seq和之前报道的MeRIP-Seq的分析效果。结果表明，m6A-ORL峰的总体富集倍数高于MeRIP。近50%的m6A-ORL峰与MeRIP重叠，并且m6A峰的分布相似，因此m6A-ORL法十分可靠。更重要的是，m6A-ORL揭示了MeRIP无法检测到的5’UTR和3’UTR区的m6A和N6,2’-O-二甲基腺苷（m6Am）修饰情况。与之前对m6Am的报道相比，m6A-ORL获得的标记位点中24%是与之前的报道重叠的。同时，m6A抗体倾向于富集大于100 nt含m6A的RNA片段。而由于空间位阻的影响，m6A-ORL对短片段更加有效。因此，m6A-ORL具有更高的分辨率，并且与MeRIP相比，为m6A甲基化组提供了新的可检测位点（图4）。图4. 细胞水平m6A-ORL法标记分析m6A验证随后，作者对m6A-ORL的分析分辨率进行了研究。首先，作者在模型RNA上的m6A-ORL-Seq的数据分析中观察到RT截短的特异性特征。该特征作者推测在m6A N6位置氢供体的缺失导致RT停止，因此可能以单碱基分辨率标记m6A位点。随后作者合成了含有m6A的15 nt寡核苷酸序列对该假设进行验证。变性PAGE表明RT反应同时停止在12 nt，即遇到m6A的衍生物时停止（m6,6A，Bm6A，Tm6A）。随后作者通过该方法对DRACH基序进行分析，结果表明共有4001个位点在RT过程中停止。过滤掉18个假阳性位点后，共得到了3983个高可信度的m6A单碱基分辨率位点。最后作者在含有m6A 的YTHDF2片段上通过miCLIP18（常用的m6A Pulldown-Seq单碱基分辨率检测方法）和m6A-label-Seq22（无抗酶依赖的m6A测序分析法）对m6A-ORL-Seq的标记准确率进行验证。实验结果表明，m6A-ORL-Seq揭示了与miCLIP一致的GGACG基序中A处的显著截短（图5）。图5. m6A-ORL-Seq分析获得单碱基分辨率的m6A位点最后，因m6A-ORL-Seq同为无抗方法，作者将m6A-ORL-Seq鉴定的m6A位点与m6A-label-Seq22和m6A-SAC-Seq24，或与m6A-SEAL-Seq23鉴定的位点进行比较，验证m6A-ORL-Seq的准确率。结果表明，m6A-ORL-Seq和m6A SAC-Seq获得的相同位点结果更多。另一方面，大多数（77%）m6A-ORL-Seq位点与m6A SEAL-Seq重合。为了进一步评估这些位点的准确性，作者通过不同的基本分辨率方法（miCLIP CIMS，18 miCLIP CITS，18 m6A REF-Seq，20 DART-Seq，21 m6A label-Seq，22 m6A-SAC-Seq24）进行共同比较。比较结果表明，m6A-ORL鉴定的m6A位点除DART-Seq外具有最高的重叠率，这表明m6A-ORL-Seq检测到的m6A位点是最可重复和最可信的。因此，m6A-ORL-Seq对于m6A的转录组区域检测是高度可靠的（图6）。总之，本文中作者报道了一种新的化学标记法，用于m6A的转录组区域的分析。该方法以单碱基分辨率、高可信度鉴定转录组中的m6A位点。m6A-ORL的机制与先前报道的基于抗体或酶依赖性方法的所有方法完全不同，因此m6A-ORL为转录组水平的m6A检测提供了新视角，有助于深入准确解读RNA甲基化。https://doi.org/10.1039/D2SC03181G
原文引用：10.1039/D2SC03181G
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