《背景介绍》

O-乙酰氨基葡萄糖基化(O-GlcNAc)是一种极其重要的蛋白质翻译后修饰(PTM)，主要发生在细胞内的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)残基上，其显著异于其它糖基化类型：1）糖链在体内极难进一步延伸，糖型结构仅为1个乙酰氨基葡萄糖糖；2）糖基化修饰动态可逆，并且处于高度动态变化中。值得注意的是，在前期工作中发现，细胞核中超过1/4的鉴定O-GlcNAc蛋白归属于转录因子，并且O-GlcNAc参与细胞代谢、信号转导、免疫应答等生理过程调控。O-GlcNAc修饰特征与磷酸化相似，并且二者之间存在着密切的Crosstalk。然而，O-GlcNAc研究远滞后于磷酸化的研究，其主要原因是O-GlcNAc修饰丰度低、缺乏有效的富集与鉴定方法。

目前，O-GlcNAc的富集方法包括：1) 使用抗体或识别结合域的直接捕捉法，其特异性和亲和力较弱，难以避免非特异性吸附，从而限制了O-GlcNAc糖肽/蛋白富集的特异性；2) 通过非天然糖基的代谢标记法或化学酶促标记法将生物兼容性的反应基团（炔基、叠氮基等）引入O-GlcNAc糖肽，再由点击化学反应进行捕捉的策略。该策略显著提高了糖肽的富集特异性，然而，点击化学等反应不可逆，容易造成糖肽修饰基团的质量标签过大，进而影响糖肽的鉴定效率。中科院大连化物所叶明亮研究员、秦洪强研究员团队前期发展了基于酶促化学标记-化学氧化-可逆酰肼化学富集的策略，实现了O-GlcNAc糖肽的高效标记氧化与可逆富集，提高了糖肽的富集效率与检测灵敏度（Anal. Chem. 2021, 93, 16618，见本公众号2021.12.17推送）。

近期工作中，该团队进一步与中科院上海药物所黄蔚研究员团队合作，提出并构建了O-GlcNAc糖肽的可逆酶促化学标记策略，将其与亲水作用色谱富集方法相结合，实现了O-GlcNAc糖基化的高灵敏度检测。其主要包括三部分：1）利用糖苷内切酶的突变体Endo-MN175Q的糖转移酶连接活性，将N-糖的内切寡糖基团转移到O-GlcNAc糖单元，提高O-GlcNAc糖肽的亲水性；2）基于延长糖链的亲水性，采用亲水作用色谱方法，实现标记O-GlcNAc糖肽的富集；3）利用野生型糖苷内切酶Endo-M/S的水解活性，进行富集后糖肽中标记糖链的释放，避免了标记糖链对O-GlcNAc糖肽鉴定效率的影响，以此实现了O-GlcNAc糖肽的无损富集与检测。

图1. 常规化学酶促标记法与基于可逆化学酶促标记的O-GlcNAc糖肽亲水富集法

作者利用标准糖肽分别对突变体Endo-M N175Q的酶连接活性和野生型糖苷酶Endo-M/S的酶切活性进行考察，结果表明该方法中化学酶促标记反应和寡糖基切除反应均比较完全，（三条糖肽的转糖标记效率均达到95%，酶切释放糖链效率均达到99%以上），并且亲水作用色谱与可逆化学酶促标记具有良好的兼容性，实现了标准糖肽的高效富集。进一步，将糖肽与BSA蛋白酶液混合用于其富集特异性的表征，结果显示该方法可以从糖肽：BSA=1：1000的混合样品中实现O-GlcNAc糖肽的富集与质谱检测，表明该方法具有优异的富集特异性。

图2. 将本文基于可逆化学酶促标记的亲水作用色谱法用于富集O-GlcNAc标准糖肽

作者进一步将该方法用于HeLa细胞核蛋白质O-GlcNAc糖基化分析，单次质谱分析即可从133 ug 样品中即可鉴定到近300条糖肽，与常规点击化学酶促标记策略的富集结果相当，而其样品用量仅为点击化学用量的1/10 (常规点击化学蛋白用量2-5 mg)。最终，研究团队从1.1 mg蛋白样品中共鉴定到1414处潜在O-GlcNAc修饰位点，其中777处（约55%）在人源O-GlcNAc糖基化数据库中收录（1985-2020年），极大程度补充了O-GlcNAc糖蛋白数据库的覆盖度。工作中鉴定到的O-GlcNAc糖蛋白中包括识别RNA上N6-甲基腺苷(m6A)的YTHDF1和YTHDF3蛋白，以及与之形成相互作用网络的另外13种蛋白，而后者与环境刺激条件下应激颗粒（Stress granule, SG）的形成密切相关。本工作为蛋白质O-GlcNAc修饰对应激颗粒形成的作用机制研究提供了新思路。

图3. 基于可逆酶促化学标记策略的O-GlcNAc糖肽富集与检测

该工作是首例O-GlcNAc糖肽的可逆化学酶促标记的报道，为生物样品中蛋白质O-GlcNAc糖基化分析提供了一种简便有效的手段。论文的共同第一作者是中科院大连化物所在读博士研究生陈尧和中科院上海药物研究所的唐峰博士。（https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202117849）

论文信息：

Endo-M Mediated Chemoenzymatic Approach EnablesReversible Glycopeptide Labeling for O-GlcNAcylation Analysis，AngewandteChemie International Edition,