分享一篇发表在JACS上的文章：The Transcriptome-Wide Mapping of 2-Methylthio-N6-isopentenyladenosine at Single-Base Resolution，通讯作者是来自武汉大学的周翔教授，周翔老师课题组致力于核酸化学生物学的研究。这篇文章中作者通过化学标记实现了转录组中ms2i6A修饰的标记和测序分析。2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷(ms2i6A)是一种在tRNA的37位发现的修饰，目前已知该修饰会影响蛋白翻译，其缺失会导致胰岛素合成异常进而诱发二型糖尿病。对该修饰传统的鉴定方法是将tRNA分离并水解为较短的寡核苷酸，再通过RNA质谱进行鉴定，但这种方法深度不足，且仅限于分析已知序列上的修饰。作者受启发于此前报道能够选择性标记蛋白质上甲硫氨酸残基的ReACT策略，希望能够利用相同的化学反应来实现转录组水平上ms2i6A修饰的标记，进而通过测序对其进行鉴定。ReACT策略的原理是氧氮杂环丙烷能够选择性地与硫醚进行反应从而对其进行标记，虽然这一反应在蛋白标记上取得了成功，但它能否与碱基上的甲硫基反应仍然未知，因此作者合成了2-甲硫基腺苷(ms2)以及ms2i6A，分别与带有叠氮基团的氧氮杂环丙烷OX-N3反应，并发现在25℃，1h的温和条件下转化率即可超过99%。随后他们又合成了12nt长度并带有ms2/ms2i6A修饰的寡核苷酸，经测试发现与OX-N3反应后同样可达到超过99%的转化率，且经过条件优化可将发生O-转移的副产物的比例降低到10%，反应产物可通过加入DBCO-S-S-biotin从而用于后续的富集。最后作者在转录组水平上对大肠杆菌中的ms2i6A修饰进行了研究，通过对RNA进行OX-N3标记进而富集，再经过逆转录进而测序，他们成功鉴定到了已知的9个tRNA上ms2i6A修饰位点中的8个，唯一未鉴定到的位点是由于其上游大量acp3U修饰造成的逆转录终止。为了实现单碱基分辨率，作者进一步分析已知的9个位点的逆转录终止率后发现， ms2i6A修饰本身会影响碱基互补配对进而导致逆转录终止，因此这些修饰位点的逆转录终止率均在50%以上，同时探针的标记对逆转录终止率影响很小，所以作者最终将终止率为40%以上的位点作为ms2i6A修饰的判断标准，根据该标准在转录组中没有检测到其它的新修饰位点，说明ms2i6A修饰在转录组中是高度保守的。总之，这篇文章利用ReACT化学标记策略实现了转录组中ms2i6A修饰的标记和单碱基分辨率的测序分析。
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c13894
文章引用：DOI：10.1021/jacs.2c13894
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