今天分享一篇2022年发表在《Nature Communications》上的文章：Cell-specific bioorthogonal tagging of glycoproteins，文章的通讯作者是来自帝国理工学院的Benjamin Schuman。Benjamin在斯坦福大学Carolyn R. Bertozzi（2022年诺贝尔化学奖得主之一）实验室的博士后工作期间开始进行对开发糖基化精确工具的研究，目前他的研究方向主要是利用基因工程、分子和细胞生物学等方法与化学合成相结合，开发用于研究活细胞和体内糖基化调控变化和糖蛋白组学的工具。
糖蛋白表达的改变是癌症发生过程中必然结果之一，理解这些变化对于癌症的研究是至关重要的，但是目前却受到细胞模型的限制。对于肿瘤来源的细胞系进行单一化培养无法对肿瘤与宿主的关系进行充分解释，但是复杂的共培养细胞模型又很少能精确捕捉到蛋白质上糖基化改变的信息。本文中，作者开发了一种糖蛋白的细胞特异性生物正交标记策略（BOCTAG），该策略中设计了一种人工生物合成途径，只有含有该途径的细胞才能利用额外添加的生物正交标记糖类似物标记糖蛋白，而野生型细胞基本不能被标记。在人类细胞的GalNAc补救途径中，半乳糖激酶GALK2和焦磷酸酶AGX1/2将未修饰的外源GalNAc逐级转化为GalNAc-1-磷酸和UDP-GalNAc。UDP-GalNAc经GALE异构酶作用转化为UDP-GlcNAc，或经糖基转移酶ppGalNAc-Ts 添加到受体底物蛋白上形成黏蛋白型糖基化修饰。共晶结构证实了GALK2和AGX1/2几乎不能容纳GalNAc的N-酰基部分的化学修饰，而利用双歧杆菌来源的N-乙酰基己糖胺基激酶 (NahK) 和mut-AGX1 (AGX1F383A) 可以将GalNAc类似物GalNAlk和GalN6yne逐级转化生成UDP-sugar类似物，随后利用CuAAC等生物正交反应对细胞表面的糖蛋白进行追踪成像等（图一）。图一：开发UDP-GalNAc/GlcNAc类似物化学标记的人工生物合成途径。接下来作者评估了BOCTAG选择性标记转染细胞糖蛋白组的能力。利用SILAC标记转染的NahK/mut-AGX1或空载质粒的K-562细胞，然后用Ac4GalN6yne或DMSO处理，CuAAC反应，neutravidin beads富集，酶解，MS分析，发现有来自85个蛋白质的多肽在转染NahK/mut-AGX1的细胞中显著富集，超过98% (84/85) 的蛋白质之前被注释含有N-或O糖基化修饰， 因此验证了该糖蛋白质组标记方法的有效性（图二）。为了评估人工生物合成途径NahK/mut-AGX1作为BOCTAG细胞类型特异性糖蛋白标记技术的适用性，将稳转NahK/mut-AGX1并表达GFP的4T1小鼠乳腺癌细胞与未转染的MLg小鼠成纤维细胞进行共培养，然后分别添加Ac4GalN6yne、Ac4ManNAlk（阳性对照）或DMSO（空白对照），发现仅Ac4GalN6yne标记信号与GFP信号高度重合，这表明只有转染了NahK/mut-AGX1的4T1细胞可以被标记上，而未转染的MLg不能被标记，因此BOCTAG使共培养中细胞表面糖蛋白的细胞特异性标记成为可能（图三）。作者下一步又将之前“Bump-and-Hole engineering”中开发的BH-GalNAc-Ts与BOCTAG策略相结合，利用工程化的ppGalNAc-Ts催化人工生物合成途径得到的UDP-sugar类似物，BH-GalNAc-Ts的过表达提高了BOCTAG化学标记糖链进入O-GalNAc糖蛋白组的能力。最后，利用BOCTAG-T2（NahK/mut-AGX1/BH-GalNAc-T2）策略对共培养不同来源的细胞或者小鼠体内标记糖蛋白，结果证明只有转染了“BOCTAG-T2”质粒的细胞或者注射了该细胞的肿瘤，并用Ac4GalN6yne处理才能被标记上，并且通过LFQ蛋白质组学分别鉴定到了人源和鼠源不同数量的糖肽和糖蛋白以及一些糖基化位点（图四）。图四：BOCTAG在共培养细胞模型和体内以细胞特异性的方式标记糖蛋白。总之，本文主要介绍了一种高效的糖蛋白标记方式-BOCTAG，可以对更加复杂的共培养细胞模型或者体内进行精确化学标记，有很高的选择性和特异性，为糖蛋白质组学的研究提供了一种新的工具。
文章引用：
https://doi.org/10.1038/s41467-022-33854-0
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