1. 证明UBER染料用于寡核苷酸荧光标记方法的可行性；

2. UBE Red染料的制备及其AP位点反应活性验证；

3. 将UBE Red染料与UBER Green染料结合，实现对有两种类型的脱氨DNA损伤DNA的双色标记。

接着，作者制备了一种新的的染料(UBE Red)，这种染料也可以与AP位点发生反应，与CCVJ-1不同的是红移波长（约620纳米）下产生15倍的荧光增强（图3a）。为了进行双色标记，作者制备了一个发夹ODN（dU/dI），其茎部有两种类型的脱层DNA损伤：（i）dU（UDG的底物），和（ii）脱氧肌苷（dI），它是N-甲基嘌呤DNA糖基化酶（MPG）的底物（图3b）。结合两种染料，通过使用两个脱氨的碱基和对每个碱基有选择性的酶可以实现双重标记。荧光强度和标记的ODN的颜色表明，每种染料都是以特定位点的方式完全结合在指定的位置上（图3c）。作者设想，在互补的目标DNA或RNA上选择性地合成荧光标记的DNA，可以应用于检测混合物中的核酸，以及在生物环境中原位合成FISH探针，同时不需要洗涤步骤（图3d）。为了测试这一点，将5条非目标DNA和1条特定目标DNA混合，然后一起使用目标特异性引物进行聚合酶/BETr原位标记（图3e）。结果显示，当目标DNA不存在时，产生的荧光强度可以忽略不计。当目标DNA存在时，随着目标DNA浓度的增加，原位荧光则表现出不断的增强。并且琼脂糖凝胶分析进一步证实，UBER的原位共价标记只在目标DNA存在时进行（图3f）。在有背景tRNA存在的情况下，用RNA模板也能获得高特异性。这表明聚合酶/BETr标记在未来可能用于检测复杂混合物中的目标DNA。

图3. 双色标记，以及对目标DNA的选择性。（a.UBER Green和UBER Red的化学结构以及在AP上的荧光增强。b.双色标记的发夹ODN包含两个不同的DNA病变与相应的糖基化酶。c.UBER标记的ODNs在凝胶照明器上沉淀纯化，在485 nm激发条件下538 nm和590 nm处的荧光强度。d.混合物中存在干扰DNA时，目标DNA的选择性标记。e.只存在干扰DNA，干扰DNA目标DNA均存在的情况下，DNA的原位合成和标记的荧光变化。f.琼脂糖凝胶电泳结果证明目标DNA的选择性标记。）

进一步，作者使用BETr进行信号等温扩增。由于到连续的AP位点会阻碍环状DNA中的荧光标记，因此，作者使用dUTP和dTTP的混合物来增加标记的平均间距。当反应中同时提供dUTP和dTTP时，最终荧光的差异表明dUTP和dTTP相互竞争，说明dUTP作为聚合酶底物的效率接近于dTTP (图4a)。然后，作者用不同比例的dUTP与dTTP进行原位RCA和BETr标记检测，以优化高效荧光标记的比例(图4b)。作者又将BETr标记用于DNA纳米结构中，结果表明，DNA四面体(TD)中的标记荧光强度高于各单链组分的标记(图4c)，同时标记后的TD可用于HeLa细胞中应激颗粒的成像(图4d)。结果显示，在扩增的开始阶段（<100分钟），较高比例的dUTP显示出更大的荧光增强，意味着更快的结合和标记。然而，低比例（<2%的dUTP）在延长反应时间时表现出更高的荧光增强。随后，作者测试了BETr对DNA纳米结构的标记能力。作者选择了四面体DNA（TD：tetrahedral DNA）纳米结构作为标记的对象，结果表明，TD的BETr标记产生的荧光强度比单个ssDNA组分高的多（图4c），这一结果证明了BETr对DNA组装的标记能力。随后，作者利用荧光TD作为G3BP1一抗的特异性探针，成功观察到清晰可见的应激颗粒，而且无需二抗，这可以减少多分析物成像中的潜在交叉反应。

最后，作者发现修复酶的选择性特性可以在标记策略中被利用，于是设计了一个具有周转潜力的DNA检测系统(图5a)。在该检测系统中，设计了一个含有MPG底物dI的DNA探针，在链的中心被设计成与目标DNA杂交。在没有目标DNA的情况下，探针本身是一个非常差的MPG底物，由于探针是单链，因此不产生荧光信号增强(图5b)。另一方面，在有互补的目标DNA的情况下，它形成一个有酶能力的双链，然后被MPG/UBER组合通过BETr修复和标记，随着时间的推移产生强烈的荧光信号增强。此外，作者还测试了与dI相对的各种碱基，以优化MPG的活性，发现当dI与dT或dG配对时，荧光信号增强最高。然后，作者进一步测试了这一策略的单次错配辨别能力。结果显示，距离标记位点1 nt或2 nt的单次错配没有导致荧光增强，显示出非常高的特异性（图5c）。鉴于染料标记的位置会破坏双链的稳定性，具有优化长度的DNA探针可能足够长，以形成一个半表层的双链，可以作为MPG的底物，但又足够短，以便在染料标记破坏双链的稳定性后解离（图5a）。作者设计了7-11 mer含dI的探针链，并测试了它们在一段时间内对目标DNA的检测（图5d）。结果发现，在37℃下，7 mer链太短，不能作为底物，而11 mer在MPG下则表现出强大的修复活性，并明显增强了荧光。为了评估周转设计的应用，作者在该检测系统中测试了探针链（11 mer）与目标DNA的不同比例下的荧光标记能力（图5e）。结果显示，一个拷贝目标DNA可以标记多个拷贝探针ODN。此外，作者还通过在探针链中引入多个脱氧肌苷，研究了对长于11 nt的序列的检测。结果显示，引入多个dI核苷酸，在病变之间有四个碱基对，有利于对更长的序列进行等温周转检测。此外，作者用较低靶标浓度(0.5 pmol)的进行测试，结果表明，5个单位的MPG可促进探针ODN约2000倍的周转(图5f)，产生相对于拷贝数显著的放大信号。这种周转系统的一个有利特点是探针链是完全无荧光和生物兼容的，这使得使用相对较高的浓度来检测一个浓度低得多的目标。

本文描述了一种广泛适用的合成后 DNA 标记策略，该策略利用 DNA 修复酶在预先引入的 DNA 损伤处产生 AP 位点，以及在反应时点亮的 AP 位点反应性转子染料 (UBERs)。标记所需的所有三个反应（DNA 损伤的插入、DNA 修复和 AP 位点捕获）相互正交并且可以同时进行，这使得能够在同一时间进行原位 DNA 合成和荧光标记通过简单混合所有组分进行单管反应。此外，该方法避免了原位测定的繁琐洗涤步骤，因为糖基化酶仅在掺入 DNA 后才切除脱氨基碱基，并且 UBER染料在 dsDNA 产物中发出高达 500 倍的荧光。将两种颜色的UBER染料和两种损伤/糖基化酶对结合起来，通过连续用dU和dI进行BETr，有利于在一个DNA中进行定点双色标记。UDG的稳健性可以修复DNA/RNA环境中的dU，也可以修复dsDNA，使原位逆转录和荧光信号检测DNA或RNA，拓宽了该策略的适用性。然后作者进一步利用MPG酶的dsDNA特异性，设计了一个强大的等温周转DNA检测系统，其中标记的ODN自发地从目标DNA上移开，不断产生荧光信号。作者还证明了在单个DNA构建体中的明亮标记，在报告等温扩增和成像应用中具有潜在的效用。作者的实验证实了在最佳dUTP/dTTP比例下，通过dUTP结合对RCA进行标记和亮化信号。为了成像，一个紧凑而明亮的DNA纳米结构 (用六个分子的CCVJ-1标记的紧凑明亮的DNA纳米结构（TD）显示出高亮度，将荧光TD拴在G3BP1的初级抗体上被利用来成功地观察细胞中的应激颗粒，而不需要二级抗体。

https://www.nature.com/articles/s41467-022-32494-8