通讯作者：Eric T. Kool

通讯地址：Department of Chemistry, Standford university

研究方向：RNA Chemical biology, DNA repair and cancer and Imaging and sensing

DNA荧光标记是基础和应用生物科学分析的基本工具。DNA标记因其准确定位、产生原位定位检测信号等优势被广泛应用于核酸检测、DNA扩增、细胞成像以及多重检测中。由于其广泛的用途，多种DNA化学标记方法被开发出来，并已经被用于DNA化学合成或酶促DNA合成过程直接将荧光团合并到DNA中的策略。这种方式产率较高且能够精准定位，但经常不稳定，且成本较高。

本文作者在前期开发了原位DNA或者dsDNAs的荧光标记策略。原理如图1所示，在特定的糖基化酶的作用下，实现碱基的脱氨并被切除，然后得到AP活性位点，继续引入通用的且具有荧光的碱基切除修复探针，从而实现DNA的荧光标记，该方法简称为BETr。作者分别使用含有dU的DNA或者RNA模板验证了BETr过程中碱基切除、修复的可行性，并将该体系应用至细胞提取的基因组中。

图1. 原位DNA合成和BETr的标记。

接下来，作者研究了DNA标记位点的数量和位置对荧光强度的影响。结果发现，高密度的标记和强的荧光强度需要两个相邻的标记之间间隔2-3个碱基，且连续的高密度标记会发生自猝灭效应。（图2）

作者进一步考察在一个DNA中进行两个荧光染料标记的正交性。并为此再开发了一种红色的荧光染料。在UDG和MDG的作用下，双标记实验成功被执行。且BETr的原位标记表现出很好的特异性，不被干扰序列影响。（图3）

最后，作者将该标记用于等温放大策略，并用于定位三维纳米结构和活细胞成像。考虑到标记之间太近会有荧光自猝灭效应，首先作者采取了dUTP和dTTP的混合物，使二者在扩增的过程中进行竞争性标记和合成，并将其用于标记滚环扩增过程。结果如图4所示。DNA纳米结果对纳米科学产生了显著的影响，因此一个能够标记DNA纳米结构组装的方法具有巨大的潜力。基于此，作者将上述原位标记用于标记DNA四面体的组装过程。并将其与修饰有核酸的一抗进行杂交，通过细胞成像来标记细胞的应激反应。

图4. 等温扩增标记以及细胞成像。

本文作者通过使用碱基切除修复原理描述了一种广泛应用的后合成的DNA标记策略。该方法合成简单，均使用市售的化学试剂，反应快速，标记的DNA荧光产率高，有500倍的荧光增强。此外，该标记性能稳定，能被用于标记DNA三维纳米结构的形成，DNA等温扩增，活细成像以及简单的DNA传感器。由于共价偶联的特异性，该标记具有良好的正交性能，在今后的多重检测中有良好的使用潜力。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-32494-8