介绍一篇2022年发表在Nature Communications上的文章，题目为“Efficient DNA fluorescence labeling via base excision trapping”。本文建立了一种通过碱基切除捕获（BETr）来实现寡核苷酸荧光标记的通用方法。
荧光标记DNA是基础和应用生物科学分析的基本工具，但通常标记方法昂贵且费时费力。因此，需要快速、廉价的荧光标记方法，并能在任意长度的DNA中产生明亮的信号。本文使用醛活性转子染料，也称为通用碱基切除报告器(UBER)来捕获脱氨基DNA碱基切除后产生的AP位点，从而产生荧光信号，实现DNA荧光标记。
本文所述标记方法包含以下三个步骤：首先是含有脱氨基的DNA链的化学或酶催化合成。然后由细菌糖基化酶切除脱氨基碱基，产生反应性AP位点，即碱基切除修复。最后，如图1a，b所示，UBER结合所产生的AP位点，两者之间形成肟键。该方法可以用于标记DNA双链或者DNA/RNA杂交链(图1c)，且作者通过一个同时进行的原位DNA合成和标记过程发现，当三个反应步骤同时进行时，荧光效果显著增强(图1d)。如图1e所示，本方法还适用于RTase介导的RNA模板延伸。作者还从HEK293T细胞中提取基因组DNA进行切口延伸和原位BETr标记(图1f)，并可以通过实时荧光强度的变化对反应进行监测(图1g)，同时还发现，使用100%的dUTP代替dTTP的荧光增强效果最高，说明gDNA中和dA配对的所有位点都用UBER标记，且不含dUTP的对照组中荧光强度可忽略不计，证明gDNA中内源性AP位点和dU的水平较低，因此背景信号也非常低(图1h)。
图1. 原位DNA合成和BETr标记。a.在DNA合成过程中加入脱氨基碱基，然后进行DNA修复和UBER标记。b.碱基切除捕获的原理。c.在dsDNA和DNA/RNA杂交链中进行BETr标记后荧光强度的变化。d.2 U/mL Klenow(exo_)条件下DNA原位合成和BETr过程的荧光强度变化.e.2 U/µL RTase条件下原位逆转录和荧光强度的变化。f.从HEK293T细胞中提取基因组DNA (gDNA)进行标记翻译和原位BETr标记。g.标记翻译和原位BETr标记过程中的荧光增强取决于dUTP相对于dTTP的相对浓度。h.根据原位标记100分钟后dUTP相对浓度的荧光强度比较。
随后，作者利用具有不同数量腺嘌呤的模板DNA，检测了DNA中标记位点的相对数量和位置对荧光增强程度和标记效率的影响。研究发现，随着腺嘌呤数量增加，荧光随之增强，但当数量达到11个时，荧光会减弱(图2a)。导致该现象的原因可能有三个：邻近标签抑制UDG酶活性；相邻染料之间的自猝灭效应(图2b)；荧光团数量过多导致双链结构不稳定。如图2c，作者还发现，模板中连续的腺嘌呤并不会妨碍荧光标记。然而，随着染料数量的增加，强度略有降低，可能是由于如上所述的自猝灭和局部DNA结构不稳定。作者还测试了DNA链末端的BETr标记效率，因为病变旁边的两侧碱基对的数量对糖基化酶的活性影响较显著(图2d)。结果表明，当病变位于距离末端2 nt以上时，UDG和CCVJ-1标记显示荧光增强。
图2 标记频率的优化。a.荧光强度取决于反应1000分钟后ODNs中标记位点的数量。b不同数量的CCVJ-1在不同距离上的荧光强度。c.原位合成和BETr标记过程中含有连续dA的模板荧光增强。d.从链末端开始的不同位置用含有一个dU的DNA进行荧光增强测量。
接下来，作者开发了一种额外的染料(UBE Red)，这种染料也可以与AP位点发生反应(图3a)。随后，作者制备了一个发夹ODN，在其茎中有两种类型的脱氨DNA损伤，结合两种染料，实现双色标记(图3b)。标记的荧光强度和ODN的颜色证明每种染料只结合在指定的位置(图3c)。作者设想，本文所研究的标记方法可以用于检测混合物中的核酸，且不需要清洗(图d)。为证明这一点，作者将5条干扰链和1条靶标链混合，然后使用目标特异性引物进行聚合酶/BETr原位标记(图e)。荧光分析显示，随着目标DNA浓度增加，原位荧光显著增强，证明了荧光标记DNA的序列特异性。琼脂糖凝胶电泳也证明，UBER的原位共价标记只在目标DNA存在的情况下进行。
图3 双色标记，以及对目标DNA的选择性。a.UBER Green和UBER Red的化学结构以及在AP上的荧光增强。b.双色标记的发夹ODN包含两个不同的DNA病变与相应的糖基化酶。c.UBER标记的ODNs在凝胶照明器上沉淀纯化，在485 nm激发时在538和590 nm处的荧光强度。d.混合物中存在干扰DNA时，目标DNA的选择性标记。e.只存在干扰DNA，干扰DNA目标DNA均存在的情况下，DNA的原位合成和标记的荧光变化。f.琼脂糖凝胶电泳结果证明目标DNA的选择性标记。
接下来，作者将BETr用于滚环扩增中。考虑到连续的AP位点会阻碍荧光增强，因此使用dUTP和dTTP的混合物来增加标记的平均间距。当反应中同时提供dUTP和dTTP时，最终荧光的差异显示dUTP和dTTP相互竞争，说明dUTP作为聚合酶底物的效率接近于dTTP(图4a)。然后作者用不同的dUTP与dTTP的比例进行原位RCA和BETr标记检测，以优化高效荧光标记的比例(图4b)。作者又将BETr标记用于DNA纳米结构中，结果表明，DNA四面体(TD)中的标记荧光强度高于各单链组分的标记(图4c)，同时标记后的TD可用于HeLa细胞中应激颗粒的成像(图4d)
图4 等温信号放大和用于标记的DNA结构。a.不同的dUTP和dTTP比值对原位DNA合成和BETr标记的荧光强度的影响。b.滚环扩增中M13mp18和原位BETr标记的荧光变化取决于dTTP和dUTP之间的相对比例。c.BETr标记的ssDNA与组装的四面体DNA的实时荧光强度。d.用标记抗G3BP1的四面体DNA观察HeLa细胞中的应激颗粒。最后，作者发现修复酶的选择性特性可以在标记策略中被利用。例如MPG只识别dsDNA中的损伤，不识别ssDNA。基于这种dsDNA的特异性，本文设计了一个具有周转潜力的DNA检测系统(图5a)。在该检测系统中，设计了一个含有MPG底物dI的DNA探针，用于与靶标杂交。在没有靶标的情况下，由于探针是单链，因此不产生荧光增强(图5b)。而在靶标存在的情况下，靶标与探针形成互补双链，然后通过BETr被MPG/UBER组合修复和标记，随着时间的推移提供很强的荧光增强。文章还进一步测试了该策略对单碱基错配的识别，发现错配距标记位点1nt或2nt时，没有荧光信号产生，表现出非常高的特异性(图5c)。随后文章设计了含有dI，长7-11mer的探针链，用于目标DNA的检测(图5d)。结果显示，在37°C时，7mer太短，不能作为底物，而11mer对MPG表现出强大的修复活性和显著的荧光增强。为了评估本方法的检测性能，作者观察了不同探针链(11mer)与目标DNA比值下该检测系统的荧光增强(图5e)。结果表明，一拷贝的靶标可以标记多拷贝的探针。此外，在较低靶标浓度(0.5皮摩尔)下的测试表明，5个单位的MPG可促进探针ODN约2000倍的周转(图5f)，产生相对于拷贝数显著的放大信号。
图5 用等温周转率和单核苷酸特异性的BETr检测目标。a.周转率检测策略的机制。b.标记探针在有无靶标时的荧光响应。c.检测到不同位置含有单一错配的靶标时荧光增强。d.当检测靶标时，荧光响应取决于探针寡核苷酸的长度。e-f.用11mer检测靶标时的荧光强度取决于探针和靶标的相对含量。
本文开发了一种用途广泛的DNA标记策略。该方法利用DNA修复酶在DNA损伤处产生AP位点，通过特别设计的染料与AP位点结合产生荧光，实现核酸链的荧光标记。在DNA纳米结构、等温扩增、细胞成像方面都有很好的应用前景。
ERIC T. KOOL（埃里克T.库尔）教授目前任职于斯坦福大学化学系。Eric教授与他的团队旨在设计新功能的分子工具，并应用它们来研究核酸的生物相互作用和机制。并希望能够以此开发用于诊断癌症的探针技术、用于生物学的荧光标签和用于检测有毒金属的荧光传感器等。
本文链接：
https://doi.org/10.1038/s41467-022-32494-8
投稿：王中钟
编辑：赵蓉 李静
审核：杨宇君
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