我们人体包含200多种细胞类型，而这些细胞都是由受精卵这个单细胞发育分化而来的，在基因组序列上完全一致，而表达的基因完全不一样。因此，染色质上的表观修饰和基因表达调控是介导细胞命运差异的关键因素。对单个基因而言，基因位点如何动态协调以调节基因表达，进而决定细胞命运在很大程度上仍然是未知的。在细胞核中，低聚物组装和凝结形成的生物分子组件（biomolecular assemblies, BAs)能与染色质相互作用，并调节该区域基因组结构和基因表达。异染色质蛋白1α（heterochromatin protein 1α, HP1α)是异染色质的重要组成成分，在体外和体内均有凝结的能力，通过凝结形成的局部高浓度可促进基因组形成BAs结构，可导致活细胞中结合位点的基因沉默。 

目前，基于非催化活性的CRISPR/Cas9 (dCas9)开发的成像系统已用于活细胞中染色质的可视化，但非重复序列的标记仍然存在标记效率低、标记复杂性高、脱靶风险高和成像信噪比低等一系列问题。在基因表达调控上，CRISPR可以将转录激活因子或抑制因子与dCas9融合来激活或抑制基因表达，例如，通过19个氨基酸的SunTag及其相应的单链可变片段(single chain variable fragments, scFv)抗体之间的高亲和力关联，可以将多个遗传或表观遗传效应分子招募到目标位点，从而增强dCas9对基因表达的调控能力。

2022年12月24日，美国加州大学圣地亚哥分校生物工程系王英晓教授团队与深圳湾实验室彭琴特聘研究员在Nature Communications 上在线发表了题为Engineering Inducible Biomolecular Assemblies for Genome Imaging and Manipulation in Living Cells的研究文章，报道了能同时实现活细胞内单个基因的跟踪标记和操控的生物分子组件(Simultaneous Imaging and Manipulation with Biomolecular Assemblies，SIMBA)系统。在SIMBA中，HP1α与mCherry-FRB融合，经化学诱导，与FKBP-scFv形成BAs，通过dCas9或内源性的转录因子来携带SunTag串联重复序列将其引导至特定基因位点，以特异性放大用于基因位点标记的信号和操控相应的基因表达。因此，SIMBA可同时可视化和操控活细胞中任何基因位点，并具有时间可控性。

为了特异性地放大标记单基因位点的信号，基于HP1α和SunTag串联重复序列之间的多层和多价相互作用，作者开发了特异性BAs形成系统SIMBA。在SIMBA中，FRB-mCherry-HP1α通过融合蛋白scFv-FKBP介导，与结合在dCas9系统上的24xSunTag (dCas9-24xSunTag)融合，实现信号放大。为了验证该系统在单基因位点上的成像效果，作者首先在HEK293T细胞中用一个端粒靶向sgRNA (TelosgRNA)测试SIMBA对重复位点的标记，结果显示，加入雷帕霉素后FRB-mCherry-HP1α 在10分钟左右出现信号点，30分钟后形成特异稳定的信号，而阴性对照细胞中mCherry在核仁中非特异分布，表明SIMBA可以特异性地标记基因组位点（图1）。进一步采用单个sgRNA实现了非重复序列基因位点IL-1B和MUC4.1的动态标记与跟踪，验证了SIMBA能够通过HP1α 的多价特性实现非重复序列的跟踪标记。

作者进一步探究了BAs的生物物理属性，通过使用1,6-己二醇破坏含有IDRs蛋白质的弱多价相互作用后，SIMBA标记在15分钟内消失，而不处理对照组则能保持12小时以上。同时，光漂白后荧光恢复(FRAP)实验结果表明SIMBA斑点的荧光在光漂白后快速恢复，揭示了BAs的动态聚集特性。

图1 SIMBA的设计及其在单基因位点标记中的应用

为验证SIMBA靶向基因表达的能力，作者首先在带有96xTetO工程化基因位点的HCT116细胞中，加入雷帕霉素，HP1α 被募集到96xTetO位点以调节热休克(HS)蛋白基因的表达。结果显示，雷帕霉素处理后HCT116细胞中单个TetO位点的斑点形成，且热击诱导HSP70基因的表达被SIMBA显著抑制。接着验证了SIMBA在内源性活化T细胞核因子(Nuclear factor of activated T-cells,NFAT)的结合位点上形成点状结构并实现基因表达操控，NFAT1的主要靶基因被抑制（图2）。

图2 SIMBA能标记内源性NFAT1结合位点并进行基因表达操控

作者进一步探讨了SIMBA介导基因抑制的表观调控机制。HP1α能直接与H3K9特异性甲基转移酶SUV39H1/2和SETDB1相互作用并募集，以促进聚集和相邻核小体甲基化。实验结果表明，SUV39H1可以被招募到SIMBA介导的HP1α生物分子元件中，而利用siRNA敲低SUV39H1/2能够显著降低SIMBA引起的基因抑制，表明SIMBA可在特定基因位点募集SUV39H1/2，导致局部组蛋白甲基化和基因表达抑制（图3）。

图3 SIMBA通过募集组蛋白甲基转移酶来调节靶基因组位点的局部转录

综上所述，作者开发的SIMBA系统，可以实现活细胞中重复序列和非重复序列的单基因位点跟踪标记，并通过HP1α局部募集组蛋白甲基转移酶SUV39H1/2来进一步操控局部基因表达。该技术理论上可用于跟踪活细胞中的任何单基因位点，并操控相应的基因表达，从而介导细胞命运。

彭琴特聘研究员为论文的第一作者和并列通讯作者，美国加州大学圣地亚戈分校的黄子亮博士为该论文的共同第一作者，美国加州大学圣地亚戈分校王英晓教授为最后通讯作者。深圳湾实验室肿瘤研究所孙坤研究员、美国加州大学圣地亚戈分校的钱煦教授、张瑾教授、钟声教授、伊利诺伊大学香槟分校的赵惠民教授等均对本研究做出重要贡献。

彭琴课题组（http://pengqin.szbl.ac.cn/）主要从事染色质活细胞成像及基因表达调控机制的研究，开发针对肿瘤等疾病相关的表观遗传修饰引起的发病机制、诊断检测和治疗的成像工具，结合深圳湾实验室医工交叉的优势，以及与国内外知名实验室开展深度合作，从肿瘤的表观遗传调控机理和治疗等方面共同推进研究工作。课题组具体研究方向为：（1）开发活细胞表观遗传修饰与染色质的新型四维（4D）标记系统，开发分子互作成像系统；在该领域已以第一作者、最后通讯作者身份发表了多篇高水平学术论文，包括Nat Commun（2022），Curr Opin Solid State Mater Sci.（2021），Proc Natl Acad Sci U S A（2018），Cell Chem Biol（2018）等。（2）研究生物力学等理化信息和能量经表观分子互作的基因表达调控规律。这一方向的多个课题将实现胞内力学传导的定量化、精准化，阐释细胞核的力学适应性。真诚邀请和热烈欢迎有志于活细胞表观修饰和染色质示踪成像以及生物力学的科研工作者（助理研究员/博士后/博士研究生）加入我们的课题组。