给大家介绍一篇来自“Nature Communications”上的文章，题名为“Spatiotemporal-resolved protein networks profiling with photoactivation dependent

proximity labeling “在这篇文章中，该课题组开发了一种光激活依赖性邻近标记 (PDPL) 方法，该方法设计将光敏剂蛋白 miniSOG基因连接到感兴趣的蛋白质。由蓝光触发并由辐照时间调整，产生单线态氧，然后实现时空分辨的苯胺探针标记组氨酸残基。他们进一步将 PDPL 应用于与疾病相关的转录共激活因子 BRD4 和 E3 连接酶 Parkin，并发现以前未知的相互作用因子。通过过表达筛选，为 Parkin 鉴定了两种未报道的底物 Ssu72 和 SNW1，其降解过程由泛素化-蛋白酶体途径介导。

PDPL平台的开发

光动力疗法 (PDT)和发色团辅助激光灭活 (CALI)，其中单线态氧通过光敏剂的光辐照产生，能够灭活靶蛋白或引发细胞死亡。由于单线态氧是一种高活性物质，理论扩散距离约为 70 nm，可以在光敏剂周围控制空间受限的氧化。他们首先测试了在 HEK293T 中稳定表达的成熟光敏剂 miniSOG和 KillerRed介导蛋白质组标记的能力，其中炔丙基胺作为化学探针。为了研究其他活性氧对标记的贡献，甘露醇和维生素 C，分别添加了已建立的羟基自由基和超氧自由基清除剂，但未发现减少标记。为了探索标记机制并通过 LC-MS/MS 实现蛋白质复合物的蛋白质组学鉴定，他们先确定了哪些氨基酸被修饰以及探针标记的 delta 质量。最终发现PDPL 以邻近依赖性方式修饰组氨酸。

图1

通过 PDPL 鉴定细胞器特异性蛋白质组

他们表征亚细胞蛋白质组以测试原位标记特异性。在 HEK293T 细胞的细胞核、线粒体基质或 ER 外膜中稳定表达 miniSOG。凝胶内荧光分析揭示了三个亚细胞位置的丰富标记带以及不同的标记模式。他们分别鉴定了 1364、461 和 911 个具有统计学意义的细胞核、线粒体和 ER 外膜蛋白质。为了分析细胞器定位的 PDPL 的准确性，他们使用了 MitoCarta 3.0、基因本体 (GO) 分析和 A. Ting 等。GO分析显示，鉴定出的蛋白质主要位于核质（26）、核膜（10）、核膜（9）和核孔（5）。结合起来，这些核定位蛋白占富集蛋白的 80%，进一步证明了 PDPL 的特异性。

BRD4结合蛋白的时空解析分析

在建立了 PDPL 在细胞器中进行邻近标记的能力后，他们接下来测试了 PDPL 是否可用于分析 POI 的结合伙伴。BRD4 形成的复合物是转录共激活因子和重要的治疗靶点。为了使用 PDPL 确定 BRD4 的相互作用图，他们将 miniSOG 与 BRD4 在 N 端或 C 端的短同种型融合。蛋白质组学结果揭示了两种构建体之间的高度重叠。由 miniSOG-H2B 确定的核蛋白质组覆盖了 77.6% 的 BRD4 相互作用蛋白。接下来，使用不同的照明时间点（2、5、10、20 分钟）来调节标记半径，发现相邻时间点之间有很高的重叠。RNA 结合蛋白 Fus 和 SFPQ 介导各种细胞过程的 LLPS，在这里确定为未报告的 BRD4 结合蛋白。共免疫沉淀（co-IP）实验验证了 BRD4 和 SFPQ 之间的相互作用。些结果表明 PDPL 是识别已知 BRD4 相互作用物以及未报告的结合蛋白的理想平台。

图2

Parkin底物的鉴定

Parkin（由 PARK2 编码）是一种 E3 连接酶，Parkin 被描述为对线粒体自噬和活性氧物质的清除至关重要。PDPL 通过在 Parkin 的 N 或 C 末端加入 miniSOG 进行了测试。用质子载体羰基氰化物间氯苯腙 (CCCP) 处理细胞以通过 PINK1-Parkin 途径激活 Parkin。为了发现未报道的 Parkin 底物，他们选择了七种已鉴定的蛋白质（PUF60、PSPC1、UCHL3、PPP1R8、CACYBP、Ssu72 和 SNW1）并转染质粒，将这些基因暴露到正常的 HEK293T 以及稳定表达 miniSOG-Parkin 的 HEK293T 中，然后CCCP 治疗。miniSOG-Parkin 稳定系中 Ssu72 和 SNW1 蛋白水平显着降低。CCCP 处理 12 小时使两种底物的降解最为显著。所以，PDPL 工作流程与目标蛋白转染验证的集成能够识别未报告的 E3 连接酶底物。

总之，他们开发了一个通用的邻近标记平台，该平台允许时空分辨地识别 POI 的交互者。该平台基于光敏剂蛋白 miniSOG，其仅约 12 kD，较小的尺寸应大大扩展研究小蛋白质相互作用组的应用范围。PDPL 还用于表征亚细胞蛋白质组，其特异性和蛋白质组覆盖率至少与其他邻近标记方法和细胞器特异性化学探针方法相当。当前版本的 PDPL 仅限于细胞环境，因为它需要蓝光照明，不能穿透深层组织。然而，光遗传学技术与 PDPL 相结合可以为动物研究提供一条途径。

作者：YXQ

责编：FJY

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-32689-z

DOI:10.1038/s41467-022-32689-z