分享一篇近日发表在Nature Communications上的文章，题目为“Identifying glycan consumers in human gut microbiota samples using metabolic labeling coupled with fluorescence-activated cell sorting”。本文工作由加拿大麦吉尔大学Bastien Castagner副教授课题组和Corinne Maurice助理教授课题组合作开展。Bastien Castagner副教授课题组擅长开发包括碳水化合物在内的小分子和天然产物类似物，Corinne Maurice助理教授课题组则对识别和表征肠道微生物群中具有代谢活性的微生物成员具有浓厚兴趣。两个科研团队经常合作，结合相互优势研究肠道微生物活性分子代谢相关课题，本文则研究了三名健康志愿者粪便中三种结构不同的寡糖的细菌摄取，即利用新开发的系列荧光寡糖类似物代谢标记人体肠道菌群样本，结合荧光激活的细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）技术和16S rDNA测序技术分离并鉴定摄入相应聚糖的肠道细菌，并通过单菌培养进行验证，作者发现了各种分类群的代谢标记特点，如普雷沃氏菌属（Prevotella copri）、柯林斯菌（Collinsella aerofaciens）和劳特氏（Blautia wexlerae）等，该方法为对肠道细菌聚糖代谢的进一步探究提供了新的方法和工具。

• 荧光修饰寡糖类似物的合成与表征

为研究肠道微生物中聚糖的摄取，作者先后设计并合成了荧光修饰的β-环糊精（图1a，CD-F，模仿淀粉螺旋结构）、nystose（图1b，NYST-F，源自常见益生元菊粉的四糖）和6³ ,6⁴-α-D-半乳糖基-β(1,4)-D-甘露五糖（图1 c，GMP-F，源自饮食中常见的半纤维素聚糖）。作者将合成的荧光修饰β-环糊精或nytose加入到K. oxytoca和L. acidophilus单菌培养体系或粪便肠道微生物样本当中，流式细胞术和荧光成像结果显示，30 min后即可观察到肠道细菌明显的荧光信号（图1 d-f），说明这些肠道细菌有效利用了β-环糊精或nytose荧光类似物。

• 荧光寡糖类似物对人体肠道微生物样本的代谢标记

然后，作者将上述三种荧光修饰寡糖类似物加入到人体肠道微生物样本中孵育1 h，流式细胞术证实了人体肠道微生物会有效摄取三种荧光修饰聚糖类似物，且摄取和标记效果在 0°C 和营养竞争条件下受到抑制，表明荧光寡糖以特定的能量依赖性方式被肠道微生物群成员吸收，并且在很大程度上与细菌代谢有关（图2）。

图2. 荧光修饰聚糖类似物对人体肠道微生物样本的代谢标记

• 人肠道微生物中聚糖觅食者的鉴定

接下来，作者将上述代谢标记后荧光⁺的细菌分选出来，提取DNA，通过16S rDNA测序鉴定细菌种类，同时与标记前的原肠道菌群做对比。结果显示，拟杆菌门作为聚糖摄取的主力，在众多肠道细菌中脱颖而出，其存在多样的多糖利用位点，从而对三种聚糖荧光类似物均能有效代谢（图 3 b, c）。Parabacteroides distasonis被环糊精标记，首次发现Blautia wexlerae (Firmicutes) 和Collinsella aerofaciens (Actinobacteria)代谢利用菊粉NYST衍生物，首次发现Alistipes communis、Bacteroides vulgatus和Bacteroides caccae可利用半乳甘露聚糖（图3 a-f）。

体外培养发现，Blautia wexlerae和Collinsella aerofaciens分别是果寡糖（FOS）和果聚糖的觅食者（图4）。

• 人肠道微生物中聚糖消费相关菌株的分离与体外培养验证

最后，作者试图从人类粪便样本中分离出特定的聚糖消费者并在体外培养中验证其聚糖利用表型。首先，用聚糖荧光类似物标记粪便细菌1 h，然后将聚糖⁺细菌分选出来并在厌氧条件下在BHI 上培养，从培养物中分离出 GMP 消费者（B. xylanisolvens CLD22001），培养 NYST-F ⁺分选细胞分离 FOS 消费者（B. uniformis CLD22005, B. angulatum CLD22003, E. coli CLD22006），并在体外培养验证上述菌株的聚糖利用表型（图5）。基因检测发现上述细菌的碳水化合物活性酶相关基因表达与其聚糖利用特性一致。