分享一篇2021年8月发表在Nature Communications的文章，题目为“Spatiotemporally-resolved mapping of RNA binding proteinsvia functional proximity labeling reveals a mitochondrial mRNA anchor promotingstress recovery”。本文的通讯作者是美国斯坦福大学遗传学、生物学和化学教授Alice Y. Ting，研究兴趣是活细胞中的蛋白质组学定位，系统神经科学的分子工具开发，细胞内高分辨率蛋白成像以及线粒体生物学。

邻近标记（PL）为蛋白质相互作用和亚细胞定位的蛋白质组学分析提供了新方法。通过将PL的时空特异性与功能蛋白质富集方法相结合，作者开发了一种PL酶（APEX）与交联蛋白质-RNA复合物相分离（PS）相结合来富集不同亚细胞单位RNA结合蛋白（RBP）的方法(APEX-PS)。并使用该方法对核、核仁和线粒体外膜RBP数据进行挖掘。

作者选择了最快的PL酶：APEX2，一种工程化过氧化物酶，可催化生物素-苯酚偶联物与蛋白质侧链（如酪氨酸）形成共价加合物，半衰期为<1ms，标记半径<10 nm。通过生物素-苯酚和H2O2在20秒至1分钟内标记活细胞。为了评估功能性PL对核磷酸化和O-GlcNA酰化的影响，作者制备了稳定表达细胞核靶向APEX2-NLS的HEK293T细胞，并用生物素-苯酚进行活细胞标记1 min。另外，作者验证了在磷酸酶或H₂O₂存在与否，该双重富集方案的特异性。

为了探究APEX-PS是否适用于核RBP富集，作者进行1分钟APEX催化的生物素化，然后在活细胞中进行10分钟的RNA-蛋白质交联，最后通过正交有机相分离（OOPS）富集交联的RNA-蛋白质复合物。在OOPS中，蛋白质分配到有机层，RNA分裂到水层，而交联的RNA-蛋白质复合物分配到中间层。洗涤后，RBP可以通过RNase消化特异性释放到有机层，并从该层中提取。为了探测核APEX-PS富集蛋白的特异性，作者检测到核RBPs hnRNPC和SRSF1，而未检测到线粒体RBP GRSF1和核非RBP ETS2。值得注意的是，GRSF1在PS步骤后富集，因为它是RBP，但在链霉亲和素珠后则不富集，因为它不是核蛋白，因此不会被APEX-NLS生物素化。

作者进行了基于TMT的多重蛋白质组学实验，其中包括细胞核靶向的APEX2-NLS和核仁靶向的APEX2-NIK3x。经过相分离、链霉亲和素富集和珠上胰蛋白酶消化为肽后，每个样品都用独特的TMT标记进行化学标记。然后将样品合并通过LC-MS/MS分析。成像显示APEX2-NLS（V5染色）和APEX生物素化蛋白的正确合并。最后，作者使用“成对ROC策略”过滤质谱数据，最终“核RBPome1”有791种蛋白质，并进行了核RBP的GO分析，以及与其他分析方法比较。作者还表明，APEX-PS可用于在生化分离无法进入的细胞核仁中发现RBP。

因此作者进一步利用APEX-PS鉴定了线粒体外膜上的RBPs，以及它们在嘌呤霉素条件下的动态变化。在基础和PUR处理条件下，分别鉴定出28个和15个线粒体外膜定位的RBP。+PUR数据集几乎完全是基础（−PUR）数据集的子集。

作者挑选了5个RBPs进行OPPS以及5-EU代谢标记验证，发现它们确实能够结合RNA，表明该数据集的准确性。作者对SYNJ2BP很感兴趣，因为它以核糖体和翻译无关的方式与RNA结合。为了进一步探测SYNJ2BP的功能，作者进行了RNA免疫沉淀和测序（RIP-seq）以确定SYNJ2BP的结合mRNA并通过CLIP（交联免疫沉淀）进行后续验证。