分享一篇2020年12月份发表在 Nat. Commun. 上的文章，该文的通讯作者是南京大学的郭子建院士。郭子建院士的研究方向主要是金属基抗肿瘤剂和人工核酸酶、金属与生物分子的相互作用、生物无机荧光成像。

线粒体-溶酶体的相互作用，包括线粒体-溶酶体膜融合（线粒体自噬）和线粒体-溶酶体膜接触（MLC），对于维持真核生物的细胞内稳态具有重要意义。由于Abbe衍射的极限这一事件无法被荧光显微镜或共聚焦显微镜来捕获。目前，MLC仅由超分辨显微镜和电子显微镜观察到的物理距离来定义，但是精确的接触位点还不能用目前的生化和细胞方法直接可视化。荧光探针技术的发展为超分辨率成像检测线粒体和溶酶体相互作用提供了可能性。监测线粒体-溶酶体的相互作用至少需要两种不同发射光谱的荧光。目前发展的荧光探针仅显示共定位，不能有效地跟踪线粒体-溶酶体相互作用的动态变化。同时线粒体受损时活性氧浓度上升，会导致细胞内分子的流动性发生改变，使得线粒体部位的黏度增加。虽然传统染料可以报告线粒体和溶酶体的形态，但它们对黏度不敏感，因此不能跟踪细胞器内部环境的动态变化。

基于以上背景，作者研发了一种可以检测线粒体黏度变化同时能够用两种不同的发射光来标记线粒体和溶酶体的荧光探针，并用结构光照明显微术（SIM）进行荧光成像，以此实现对线粒体-溶酶体相互作用的实时动态监测。

图 1   Coupa 的构建思路示意图。

探针Coupa整体由于分子内电荷转移（ICT）在650 nm处发红色荧光。在正常生理条件下，一部分探针通过胞吞进入溶酶体并发出650 nm的红色荧光(即Coupa-lyso荧光)；同时由于探针带有一个正电荷，一部分能够靶向到线粒体中，线粒体中存在多种活性硫(RSS)，在线粒体的碱性微环境下，活性硫表现出良好的亲核进攻能力，从而破坏部花菁的碳骨架，最终导致只有香豆素部分发蓝光(即Coupa-mito荧光)用于线粒体标记。

图 2  Coupa的化学表征。（a）（b）405 nm和560 nm激发下Coupa和不同活性硫的荧光光谱测定；（c）（d）405 nm和560 nm激发下Coupa和不同黏度介质(甘油/甲醇混合溶剂)的荧光光谱的测定; （e）（f）在535 nm和670 nm发射下，Coupa在不同的黏度下的荧光寿命图。

为了证实探针的发光特性，作者用硫化钠作为硫化氢的供体，用亚硫酸钠作为二氧化硫的供体（2a、2b），来模拟富含活性硫的线粒体微环境。如预期所示，在存在任何一种活性硫时，部花菁荧光明显下降，而香豆素部分没有明显的变化，多种活性硫存在时可以有效地猝灭部花菁的荧光。接下来作者测定了Coupa在不同黏度中的荧光光谱。结果表明，Coupa的两个发射峰对黏度都很敏感。

图 3  SIM成像下Coupa的细胞实验。（a）未处理HeLa细胞中线粒体与Coupa (405 nm激发)和MTG (488 nm激发)共染色；（c）CCCP处理的HeLa细胞与Coupa (405 nm激发)和MTG (488 nm激发)共染色;（e）CCCP处理的HeLa细胞与Coupa (561 nm激发)和LTG (488 nm激发)共染色; （b）（d）（f）图为（a）（c）（e）的局部放大图；（g）Coupa同时染色线粒体和溶酶体模型图。

作者随后验证了Coupa对线粒体和溶酶体的共定位效果。如图3a、b所示，Coupa-405通道图像中线粒体中有微弱的荧光，用线粒体商业化染料(MTG)共染色30分钟，随后的SIM成像显示，蓝色荧光颗粒和MTG标记的线粒体有较好的定位效果。作者使用了一种常见的线粒体吞噬诱导剂 (CCCP)诱导线粒体自噬，结果显示经CCCP诱导后处理的HeLa细胞的线粒体由丝状变成球形，且受损线粒体中的蓝色荧光明显高于未处理HeLa细胞(图3d)，这种增强可能与线粒体收缩增加线粒体膜的局部黏度有关。同时作者用商业化溶酶体染料（LTG）和Coupa共染色，如图3e、f所示，Coupa-561通道图像中溶酶体中有明显的红色荧光，且与LTG有较好的定位效果。

图 4  Coupa成像监测线粒体-溶酶体在线粒体吞噬中的相互作用。（a）Coupa染色的线粒体/溶酶体和DAPG染色的自噬体在用CCCP处理过的细胞中的共定位；（b）（c）为图（a）的局部放大图；（d）在线粒体吞噬过程中线粒体和溶酶体的相互作用；（e）为图（d）的数据输出图。

作者利用Coupa跟踪线粒体-溶酶体相互作用中的线粒体自噬过程。作者用Coupa对HeLa细胞进行预染色，跟踪了线粒体-溶酶体从接触到融合的30分钟内的线粒体自噬的动态过程(图4d)。在此过程中，溶酶体的红色荧光逐渐减少，而线粒体的蓝色荧光增加(图4e)。这一结果表明，Coupa能够直观地看到Coupa-mito和Coupa-lyso的融合依赖、抗相关荧光变化的线粒体自噬动态过程。

图 5  Coupa成像线粒体-溶酶体接触位点。（a）Coupa和MTG染色的线粒体在CCCP处理细胞中的荧光分布；（b）Coupa和MTG共同染色未处理HeLa细胞中线粒体嵴的分布；（c）是图（b）的荧光强度数据输出图；（d）MTG和Coupa染色未处理HeLa细胞中线粒体和溶酶体接触的动态过程；（e）为图（d）的数据输出图；（f）线粒体-溶酶体接触位点模型图。

通过测量Coupa-mito的荧光强度分布，作者揭示了线粒体内的黏度分布。CCCP处理细胞中Coupa-mito染色的线粒体显示明显的荧光强度分布不均（图5a），证明受CCCP诱导的受损线粒体的局部黏度增强。为了获得CCCP损伤前线粒体结构的黏度分布，作者用MTG和Coupa对未处理的线粒体进行共染色。SIM共定位成像显示MTG荧光可以清晰显示整个线粒体嵴结构，嵴间距离在100 ~ 200 nm ，而线粒体嵴仅少数区域被Coupa-mito染色。这证实了Coupa的目标是线粒体的内膜。

最后，作者测量了活细胞中溶酶体接近线粒体时Coupa-mito的荧光。由图d可以看出Coupa-mito标记的蓝色荧光位于线粒体和溶酶体之间，在没有MLC的区域没有出现蓝色荧光。验证了当溶酶体接近线粒体形成有效的MLC位点时，Coupa-mito的蓝色荧光会增加，在这个位点上蛋白质簇可能导致局部黏度增强。

综上所述，本文开发了一种双标记探针Coupa，能够通过功能性荧光转换同时标记活细胞中的线粒体和溶酶体。相比与其他线粒体和溶酶体探针或商业线粒体和溶酶体染料相比，Coupa能够报告溶酶体线粒体作用的详细中间体，因为在线粒体自噬的过程中它的反关联荧光信号变化（Coupa-mito的蓝色荧光增加,Coupa-lyso的红色荧光减少)。Coupa将有利于描述线粒体自噬过程中具体步骤的调节机制的基础研究和转化研究。

作者：张晓婷

核稿者：王慧

上传者：苏迪

原文链接:

https://doi.org/10.1038/s41467-020-20067-6

原文引用：

DOI: 10.1038/s41467-020-20067-6