分享一篇来自“Nature Communication”的文章，名叫“Spatiotemporally-resolved mapping of RNA binding proteins viafunctional proximity labeling reveals a mitochondrial mRNA anchor promoting stressrecovery”。这篇文章的通讯作者是来自斯坦福大学的 Alice Y. Ting（生物学、遗传学）教授。她的课题组一直对proximity labeling有着深入研究，目前正在开发新型邻近标记酶和标记化学品、功能邻近标记以及邻近标记方法的单细胞版本，使活细胞中的蛋白质组学和转录组学作图和发现具有前所未有的空间和时间分辨率。本篇文章主要就是介绍其课题组新研发的一种功能临近标记方法，发现了一些无完整膜结构的亚细胞单位上的RNA结合蛋白（RBPs），进而探究该类蛋白的功能，最终揭示了一种RBPs——SYNJ2BP能促进受到应激压力后的线粒体恢复的作用。酶的临近标记(proximity labeling)代替了传统方法（共免疫沉淀或生化分离）用于研究蛋白质组学，PL探针可以在活细胞中标记翻译组或RNA。邻近标签技术相当成熟，由APEX2和TurboID等混杂酶介导的邻近标记方法使活细胞中的蛋白质组学和转录组学作图和发现具有前所未有的空间和时间分辨率。RBPs（RNA结合蛋白）在人类蛋白质组中构成一个重要而大的功能亚类，尽管它们可以为线粒体蛋白质翻译的机制提供线索，但以前哺乳动物线粒体外膜(OMM)上的RBPs还没有被探索过。文章主要分为三大点对整个实验进行了介绍。首先，提出了目前标记技术存在的可改进的空间：传统的标记方法无法获得时空动态性的蛋白质标记结果和有许多的已被注释到的RPBs的功能尚未被揭示。其次，从发展新的特异性PL功能标记方法、核内RBPs的蛋白质组学研究、线粒体外膜上SYNJ2BP蛋白的功能研究这三个方面展开介绍。 文章通过将APEX2标记方法与不同的蛋白质富集方法相结合，从而成功的特异性标记到磷酸化和糖基化以及RNA结合的蛋白质（图1）。随后，选择将APEX2标记与有机水相富集分离（OPPS）方法相结合，成功的富集到RBPs。制备了稳定表达核靶向APEX2-NLS的HEK293T细胞，并用生物素-苯酚进行1min活细胞标记。图2展示了整个标记方法的示意图。PL探针标记过程自由基半衰期<1ms，标记半径<10nm，H2O2诱导时间20s—1min。为了探究这种双富集方案的特异性，对已知的核磷酸化蛋白以及其他亚细胞区域的磷酸化蛋白进行了免疫蛋白印迹分析（图3），其中H2O2的作用是激活PL探针生成活性中间图与氨基酸发生结合，达到标记目的。FA的作用是使RNA结合蛋白在有机水相富集的过程中聚集到中间相中。通过相分离的结果显示，只有加入了FA的实验组才显示印迹条带；在通过亲和素富集后，只有使用探针标记过的样品才有印迹条带出现。图3（d）中前两个蛋白是核定位的RBPs，因此可以通过APEX2-PS方法富集标记；而GRSF1是线粒体定位的RBPs、ETS2属于非RPBs，所以通过该方法无法被标记以及富集。另外，实验还对标记富集方法进行了优化，即对FA、H2O2的使用顺序进行探究。结果发现，FA先于H2O2会破坏细胞膜的通透性，进而导致被激活的PL探针活性中间件会泄露到其他的亚细胞结构中，使特异性标记的效率降低。（2）特异性标记核仁以及细胞核的RBPs，进行蛋白质组学实验，并且发现新的低丰度RBPs文章随后进行了TMT标记的蛋白质组学实验，包括核靶向的APEX2-NLS和核仁靶向的APEX2-NIK3x。实验设计(图4a)由在HEK293T细胞中表达的每个结构的三个生物复制，以及三个省略APEX2、过氧化氢或FA的对照组成。文章使用了两种方法对实验结果进行处理，最终选用以ROC策略为标准的数据分析方法。使用了已知的真阳性核RBPs蛋白质组数据和假阳性线粒体组RBPSs蛋白质组为分析组，将数据导入匹配，最终同一种蛋白在两个及两个以上实验组出现的结果才判定为是真核内RBPs。在通过人工过滤掉糖基化蛋白后，最终富集到791个蛋白。并且通过GO富集分析，发现这些蛋白参与的大多数通路都与RNA有关。（3）特异性定位线粒体外膜（OMM）上的RBPs揭示（SYNJ2BP蛋白）会促进线粒体受到应激压力后的恢复图5：TMT标记的OMM上RBPs蛋白质组学实验及结果为了鉴定OMM定位的rbp，稳定表达APEX2-OMM的HEK293T细胞在两个生物复制中进行接近生物素化、FA交联和相分离，而在TMT11-plex实验中使用胞质APEX2-NES作为空间参考对照。通过上述同样的蛋白质组数据过滤方法，最终分别在-PUR处理和+PUR处理的实验中富集到了28和15个OMM上的RBPs。接着，选择了其中5种蛋白质进行反向验证，分别是TAX1BP1、RMDN3、MARC1、, RRBP1以及SYNJ2BP。使用UV-APEX-PS和代谢标记方法，所有这5个蛋白都被验证为真正的RBPs。最后，实验选择了一个最感兴趣的SYNJ2BP蛋白进行了功能探究。实验进行了RNA免疫沉淀测序(RIP-seq)来鉴定SYNJ2BP的潜在mRNA客体。在富集的>100mrna中，选择了11个线粒体相关的倍富集值的mRNA进行CLIP（交联免疫沉淀）再次进行验证。所有这些蛋白都在OMM上通过APEX-seq富集。同时，在PUR处理后重复了CLIP分析，再次发现所有11个mRNA客体都富集到相似的程度，这表明SYNJ2BP与这些mRNA结合，而与核糖体活性无关。另外，影像学检查证实，经PUR处理后，SYNJ2BP仍定位于OMM上。图6：(g)SYNJ2BPKO在PUR处理后的印迹结果;(c)SYNJ2BP KO后在PUR处理过程中对Complex的损伤情况随后，实验采用了“Knock out”的验证方法，探究这11种mRNA的定位是仅由SYNJ2BP引导还是存在其他因素影响。使用野生型和SYNJ2BP敲除HEK293T细胞。印迹结果显示，当SYJN2BP KO时，11个mRNA中有5个在OMM处显著减少(图6）（仅适用于PUR处理的条件）。因此可以得出结论，PUR处理后SYNJ2BP是在OMM中保留特定mRNA子集的主要机制。这5个mRNA编码了3个OXPHOX相关蛋白（UQCR11、PET117、RAB5IF）、MRPS117（线粒体核糖体成分）、MTFP1（线粒体裂变因子。UQCR11是complexⅢ的其中一个亚基、complexⅢ的组装需要PET117参与。PET117突变也导致complexIV组装缺陷导致神经发育退化。因此，复合物Ⅰ-Ⅳ仅在KO细胞中，在应激恢复过程中活性下降，未能恢复到之前的活性水平，而在野生型细胞中没有。说明了当SYNJ2BP蛋白被敲除后，相关的mRNA失去结合位点，无法进行翻译过程，导致在PUR应激过程中相关蛋白的减少，从而影响了线粒体的整体功能。图7：细胞增值实验曲线以及线粒体ATP水平测量结果最后，实验选择细胞增值实验，对线粒体ATP产生水平的角度来验证SYNJ2BP蛋白功能。在葡萄糖中生长的细胞通过有氧糖酵解和线粒体谷氨酰胺氧化获得ATP，而在半乳糖中生长的细胞的大量ATP来自线粒体呼吸。葡萄糖培养基中，WT和SYNJ2BP KO细胞在基础条件下生长相同，但经过PUR处理后，SYNJ2BPKO细胞的生长速度比野生型要慢。说明了SYNJ2BP也会通过影响线粒体产生ATP促进其在PUR应激状态下的恢复。在CHX处理下，OMM定位的mRNA可以被多聚体保留，从而使细胞以SYNJ2BP独立的方式存活（图7c）。当细胞在半乳糖中生长以增加对线粒体呼吸的依赖时，在PUR处理后，SYNJ2BPKO对细胞生长的影响变得更加明显(图7d)。还直接测量了ATP水平，发现在PUR处理后SYNJ2BP KO降低了半乳糖培养细胞中的ATP，但在基础或CHX处理条件下没有降低(图7e)。该文章提出将传统的临近标签技术和多种多样功能性富集技术相结合，最终选择了一种APEX2-PS功能性的标记RNA结合蛋白方法，使得探针具有较高的特异性和敏感性识别出的RBPs。APEX2-PS可以应用于无法进行生化分离的的亚室的RBPs发现，如核仁和线粒体外膜(OMM)，拓宽了该领域的研究前景。SYNJ2BP蛋白能促进受到应激后的线粒体恢复的功能发现，也为线粒体蛋白质翻译的机制提供新的线索。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-25259-2原文引用：https://doi.org/10.1038/s41467-021-25259-2
目前评论：