为大家分享一篇发表在Nature Communications上的文章，文章的题目是“Spatiotemporal-resolved protein networks profiling with photoactivation dependent proximity labeling”，通讯作者是来自深圳湾实验室的李刚老师，李刚老师的实验室主要进行化学蛋白质组学和核酸化学生物学的研究。在这篇文章中李老师的团队基于光敏蛋白miniSOG开发了一套叫做“PDPL”的临近标记策略，并将其应用在BRD4和Parkin的相互作用蛋白的发现中。
研究蛋白质相互作用网络对了解生物过程、疾病病理非常重要，最初人们通过亲和质谱AP-MS的方法来研究目的蛋白的相互作用蛋白，并将其与定量技术结合，但其仍无法全面的鉴定较弱或者瞬时的相互作用。为了解决这些问题，非天然氨基酸UAA的相关方法被开发出来，通过在POI上引入交联官能团来捕获其相互作用蛋白，但UAA方法仍需要找到合适的UAA插入位点。另一个思路是酶促的临近标记PL，例如BioID，它将生物素连接酶融合在POI上，最终在临近的Lys上标记上一个生物素，该方法的局限性是用时较长，需要超过12 h才能获得足够的标记信号。TurboID虽然大幅减少了标记时间，但需要外源加入生物素分子，存在背景信号的问题。基于过氧化物酶的APEX方法则需要高浓度的过氧化物作为底物，可能对氧化还原的通路造成干扰。作者将目光聚焦在了单线态氧上，单线态氧具有很短的半衰期和有限的扩散半径，其会氧化多种氨基酸并使它们与胺基或者巯基探针反应。目前单线态氧已被应用在亚细胞尺度的RNA标记，但还没有蛋白临近标记的工作。因此作者希望通过光控的方法，高时空分辨地产生单线态氧，进而用胺基化学探针进行标记，从而实现临近标记的目的。作者首先进行了光敏蛋白的筛选。作者分别在POI上融合了2种光敏蛋白miniSOG和KillerRed，并用炔丙基胺作为化学探针，筛选出了miniSOG；接着比较了一系列胺基化学探针，选择了信噪比最好的苯胺探针。最后作者完成了实验方法的建立：外加1 mM的苯胺探针，用460 mm蓝光照射20 min即可完成临近标记，且未观察到显著的细胞毒性。接着作者将该方法推广到TOP-ABPP。作者在HEK293T中瞬转了线粒体定位的mito-miniSOG，完成临近标记后的样品裂解后依次用光切biotin-azide标记、中性亲和素富集、on-beads酶切、光切，最后通过LC-MS/MS分析、MSFragger opensearch对标记位点进行鉴定。作者惊讶的发现他们只鉴定到了组氨酸的修饰，这可能是苯胺探针的选择性导致的。体外验证实验中作者尝试使用PDPL来鉴定miniSOG-His与anti-His抗体的相互作用，也成功在抗体上鉴定到了大量生物素化修饰。
完成PDPL方法的建立后，作者分别在细胞核、线粒体机制和内质网外膜中稳定表达了miniSOG，并平行使用TurboID进行对比。结果显示PDPL能标记到更多的蛋白，与数据库对比能达到大于70%的准确度，尤其是线粒体定位的数据能覆盖到已知线粒体定位蛋白的91.7%。最后作者将该方法应用在了含溴结构域蛋白BRD4的相互作用蛋白和E3泛素连接酶Parkin的底物蛋白的鉴定中。
总之，在本文中，作者基于光控产生单线态氧的策略，开发了一种miniSOG光敏蛋白酶促的临近标记策略，并成功将其应用在未知底物鉴定中。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-32689-z原文引用：DOI：10.1038/s41467-022-32689-z
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