分享一篇2022年10月份发表在Nat. Commun. 上的文章，该文的通讯作者是斯克里普斯研究所的Kate S. Carroll教授。Kate S. Carroll教授的研究方向是研究与疾病状态相关的硫生物化学、开发研究半胱氨酸硫醇氧化还原修饰的新工具、分析与疾病相关的蛋白质氧化变化、开发疾病诊断和治疗方法。Renan B. Ferreira为该文的第一作者。
蛋白的次磺化是蛋白质半胱氨酸上的-SH被活性氧(H2O2)氧化产生次磺酸(Cys-SOH)的过程。作为一类关键的蛋白质氧化修饰，蛋白的次磺化与氧化应激密切相关，以氧化还原变化为触发，用于蛋白质结构、功能的调节及细胞间的信号转。次磺酸中的亲电硫原子也可与蛋白质或低分子量硫醇反应形成二硫键，或在过度氧化应激条件下，可进一步氧化为亚磺酸和磺酸。无论是稳定的还是暂时的中间体，次磺酸都是生物氧化还原调节领域的关键修饰物。基于次磺酸上-SH的亲电性能已开发了多类检测次磺酸的羰基亲核结构，如1.3-环己二酮，NBD，环辛炔等。其中，1.3-环己二酮由于其对次磺酸较好的选择性而发展较为广泛。2007年报道了首个基于1.3-环己二酮结构的次磺酸荧光探针，由附着在1,3-环己二酮C-4位置的荧光素组成，但由于缺乏“开启”荧光或荧光反应，其应用受到限制。2016年，Carroll教授课题组发现了非那烯-1,3-二酮可作为一种化学支架，在与次磺酸的反应中具有荧光潜力，随后调整结构开发为比率探针，然而，由于反应速率极慢（0.01 M−1s−1）且缺乏启动荧光信号而无法进行实际应用。因此，目前用于检测次磺酸的荧光生成型探针尚未见报道。
基于以上，作者开发了首个用于检测活细胞中次磺酸的荧光生成型探针CysOx（图1）。作者对非那烯-1,3-二酮支架进行三个关键的结构改变: (i) C-3位置用吸电子能力强的磺酰基取代羰基以提高反应速率; (ii) C-7位置引入氨基以创造一个电子“推拉系统”体系，且增强了结构的水溶性；(iii) C-6位置引入氟基以稳定激发态，增强吸收和荧光。CysOx探针在反应前由于存在烯醇式和酮式的互变异构而荧光猝灭，当探针与次磺酸上亲电硫原子的结合，使结构趋向于酮式，以此稳定了荧光，致使荧光开启。利用该探针，作者开发了一个高通量筛选用于调节细胞中蛋白次磺化的激酶抑制剂的平台，最终确定了一组GSK3激酶抑制剂可显著增加蛋白的次磺化修饰，并发现以上修饰定位于氧化应激相关蛋白的发挥调节作用的半胱氨酸上。这些研究突出了蛋白次磺化的荧光生成型成像检测在氧化还原生物学和药物药理学的未来研究中具有广泛的应用。
图 2 非那烯-1,3-二酮衍生物的动力学和荧光表征。首先，作者共合成了8种非那烯-1,3-二酮衍生物。随后，作者评估了化合物1-8的动力学和荧光特征。如图2所示，化合物7（CysOx1）和化合物8（CysOx2）与次磺酸小分子模型反应后可以兼具荧光性、水溶性、快速反应性及高选择性。图 3 复杂生物环境中CysOx反应性和荧光性能评估。接下来，作者评估了复杂生物环境中CysOx反应性和荧光性能。如图3所示，化合物7（CysOx1）和化合物8（CysOx2）可与离体蛋白中及细胞中的次磺酸反应并产生荧光。图 4 CysOx2探针用于活细胞中次磺酸的免洗荧光成像。作者进一步将CysOx2探针应用于活细胞中次磺酸的免洗荧光成像。如图4所示，作者评估了CysOx探针在使用0.2、2和20 U/mL葡萄糖氧化酶（GOX）连续刺激生成H2O2时可视化蛋白次磺化的能力。与未处理细胞的相比，在CysOx2存在时，可观察到荧光强度呈现显著的时间依赖性（图4a，b）。用CysOx2孵育的细胞裂解物的凝胶荧光分析也显示，CysOx2对浓度和氧化还原依赖的蛋白质进行了标记（图4c）。总的来说，这些研究表明，CysOx探针与次磺酸中的亲电性硫的反应是一种可行的方法，可用于在试管中和活细胞中实时荧光检测半胱氨酸的氧化。图 5 CysOx2探针高通量筛选用于调节蛋白次磺化的激酶抑制剂。半胱氨酸氧化与磷酸化等翻译后修饰之间的相互作用已有报道，但激酶抑制与半胱氨酸氧化之间的相互作用尚不清楚。为了进一步展示探针CysOx2在检测半胱氨酸氧化中的效用并解决上述问题，作者将CysOx2用于高通量筛选调节蛋白次磺化的激酶抑制剂。如图5所示，8%（154个化合物中的12个）激酶抑制剂的荧光增加了3倍或更多。蛋白质次磺化与TK、AGC和CMGC激酶家族成员的抑制呈正相关，其中激酶GSK3的特异性抑制剂SB-216763显著增加蛋白的次磺化，相当于外源性过氧化物。此外，荧光成像和凝胶荧光分析也证实了SB-216763增加蛋白质次磺化的能力。GSK3抑制剂处理和半胱氨酸氧化之间的联系引起了作者的兴趣，因此，作者进一步分析了GSK3抑制下的次磺化蛋白组学分析。作者基于质谱探针BTD的化学蛋白质组学量化了次磺化位点特异性变化。如图6所示，SB-216763对蛋白的次磺化产生了最显著的扰动，16%的位点表现出显著的增加，这些数据与激酶抑制剂的荧光筛选结果非常一致。此外，作者还发现在GSK3抑制剂SB-216763的作用下，发生次磺化的蛋白大多与氧化还原过程相关，且定位于抗氧化酶中发挥调节功能的半胱氨酸上。综上所述，作者开发了首个用于检测次磺酸的荧光生成型荧光探针。利用化合物8（CysOx2）高通量筛选用于调节细胞中蛋白次磺化的激酶抑制剂；蛋白的次磺化与TK、AGC和CMGC激酶家族成员的抑制呈正相关，并与GSK3的相关性最强，其中GSK3是神经疾病的一个有希望的靶点；GSK3抑制剂处理细胞的蛋白组学图谱显示，发生次磺化的蛋白大多与氧化还原过程相关，且定位于抗氧化酶的发挥调节功能的半胱氨酸上。该研究突出了激酶抑制剂调节蛋白次磺化的能力，有希望在快速发展的氧化还原医学领域找到广泛的应用。https://www.nature.com/articles/s41467-022-33124-zhttps://doi.org/10.1038/s41467-022-33124-z
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