对生物分子进行选择性的化学修饰为生物和生物医学研究提供了重要的工具。其中，生物正交标记反应已经被成功地用于序列识别、病毒感染检测、蛋白交联、代谢途径的阐明和耐药敏感机制的探讨之中。目前，这种生物正交标记主要通过以下几种方式：铜催化或张力促进的叠氮化物-炔烃环加成反应（CuAAC/SPAAC）；烯烃和四嗪之间发生的逆电子效应Diels-Alder反应（IEDDA）；四唑的1,3-偶极“光点击”加成反应。尽管这些方式在体外已经取得了一定的进展，但它们在体内的表现却不尽如人意，具有一定的局限性（仅限作用于RNA单链、具有光毒性、反应速度慢）。针对这一问题，来自加拿大麦吉尔大学的Nathan W. Luedtke教授课题组设计了一种针对核苷烯烃基团的成像探针，取名为“PINK”（Probe for Imaging Nucleosidic AlKene groups）。该探针结合了荧光嵌入剂和四嗪，其中四嗪既可作为生物正交官能团又可作为荧光猝灭剂。

PINK本身是非荧光的，它可以通过与双链DNA上的碱基发生堆积而嵌入其中，且这个过程是可逆的。通过不断的嵌入与脱出对DNA进行“扫描”，直到遇到乙烯基修饰的核苷酸（VdU，人为添加进入活细胞或动物中）后快速发生IEDDA反应并放出荧光（图1）。这种方法为活细胞中DNA复制提供了第一个无需洗去未结合荧光分子、只需简单混合即可检测荧光的方法。

首先，作者以苯胺1为起始原料，与芳基溴2进行Buchwald Hartwig交叉偶联反应。所得仲胺在与Lewis酸性硅胶接触时自发环化，得到吖啶腈3。最后将3与肼、Zn^II和乙腈反应，然后用NaNO₂氧化，引入不对称甲基四嗪得到PINK（4）。

为了评估PINK在双链DNA中可逆嵌入的能力，作者监测了加入小牛胸腺（CT）DNA后PINK的吸光度。和预期一样，加入CT DNA后，可以观察到PINK吸光度的红移（图3a）。为了进一步评估它们的结合模式，在PINK存在的情况下，作者对不同浓度的DNA溶液进行了粘度测量。与Lerman对DNA嵌入剂的假设一致，PINK的加入会导致DNA溶液粘度（η）增加，并在PINK和DNA碱基对之间表现出1:5的化学计量比（图3b）。此外，通过监测PINK随DNA浓度增加的吸光度变化的化学计量学，作者估计其表观解离常数（K_D）= 5.1 μM（图3a）。它表现出的DNA亲和力与其他吖啶衍生物类似，说明PINK中的四嗪部分不会干扰DNA结合。PINK（4）与VdU（5）能够进行高荧光和区域选择性的IEDDA反应（图2），在二者反应过程中，可以观察到荧光增加了100倍（图3c）。此外，图3d说明PINK-VdU反应产物（6）的量子产率（ϕ_F）在3.5 %到19%之间，这与所使用的溶剂相关。

为了评价PINK进入活细胞并与天然染色质中的乙烯基进行反应产生荧光的能力，作者使用Hela细胞进行了测试。在共聚焦荧光显微镜下，成对的、具有亮粉色荧光的子细胞仅在VdU处理的细胞中可以看到, 并且在PINK和非共价核染色Hoechst 33342之间观察到明显的共定位。这些结果说明了PINK成功实现了在活细胞内对VdU的成像（图4）。

为了研究VdU-PINK标记对后续DNA合成的潜在影响，作者用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）进行了pulse-chase实验（图5a）。先用20 μM VdU孵育细胞16 h，接着用PINK孵育4 h。然后添加EdU 孵育4 h作为追踪剂，通过细胞固定和铜催化炔烃与荧光叠氮化物环加成观察DNA合成。如图5a中展示，PINK+和EdU+双阳性细胞呈现出共定位核染色。这些结果表明，PINK-VdU反应产物没有引起细胞周期阻滞。基于上述结果，文章的最后，作者使用VdU和PINK来追踪DNA的合成和细胞分裂，成功地记录了完整的有丝分裂周期（图5b）。

总而言之，本文开创性地通过双重增强策略开发了具有吖啶荧光剂与四嗪结构的探针PINK。其中吖啶部分既可作为荧光探针，也可作为速度增强的嵌入剂；同时，四嗪部分可以作为荧光猝灭基团和生物正交官能团。这是第一个能够在活细胞中与核酸共价反应时显示荧光增强的荧光嵌入剂。以往利用生物正交法对细胞内乙烯基修饰的DNA进行化学标记的研究都依赖于细胞固定和变性来促进四嗪-烯烃反应。本文的策略使得吖啶修饰的核酸在分裂细胞中的活细胞动态成像成为可能。