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英文原题：Label-free single-molecule pulldown for the detection of released cellular protein complexes
通讯作者：Shaopeng Wang (王少鹏) 作者：Guangzhong Ma (马光中), Pengfei Zhang (张鹏飞), Xinyu Zhou (周新宇), Zijian Wan (万梓健)
背景介绍 蛋白质是细胞发挥功能的执行者，分析蛋白及其复合物的组成是了解细胞功能的重要手段。传统蛋白分析方法如SDS-PAGE和Western blot需要大量的细胞才能达到所需样品含量；而且蛋白及其复合物在强表面活性剂作用下分解或失活，无法保留其原有结构和组分。以单分子荧光成像为代表的单分子测量已经广泛应用于生物分子的检测，有高分辨率高灵敏度的特点，且维持了蛋白复合物的完整性。然而，荧光具有易淬灭的缺点，导致难以对样品进行长时间持续观测。同时，荧光信号来源于标记物而非分子本身，使得分子的本征信息（如质量等）很难通过荧光信号表达。用荧光去标记细胞内分子的过程也较为繁琐。 文章亮点 来自美国亚利桑那州立大学的王少鹏(Shaopeng Wang)课题组近期提出一种免标记的单分子成像方法，用于测量细胞内的蛋白和蛋白复合物。该方法利用表面等离子共振散射显微镜（Plasmonic Scattering Microscopy, PSM），通过细胞原位裂解、胞内蛋白释放、单分子免疫分析的手段，实现了对细胞内蛋白和复合物组分的精准测量。该方法灵敏度高，仅需几十个细胞就可对胞内蛋白进行单分子级别的测量，可对样品量低的稀有细胞和分子的测量提供帮助。
图文解读 PSM显微镜是一个基于表面等离子共振原理的免标记单分子成像系统，目前已经应用于单个蛋白分子测量，单分子相互作用，单细胞形态分析等领域。PSM的工作原理是对位于金膜表面激发的表面等离子共振倏逝场中的分子进行光学成像，并通过测量单分子的散射光强度，对分子的大小、形态、动力学等进行分析。本工作进一步将PSM的应用范围推广到细胞内分子的测量，阐述了PSM在细胞复杂体系中的工作原理，并对未来PSM应用于单细胞单分子分析打下基础。 图1. PSM应用于细胞内分子测量原理。 图1a展示了PSM用于细胞观测的装置图：细胞培养于流道上表面，下表面为入射光激发的表面倏逝场。当细胞裂解液流过细胞时，细胞被裂解并释放出胞内分子（包括蛋白和蛋白复合体），并通过扩散接触下表面。落在下表面的分子通过散射倏逝场的光（范围为表面100 nm）被位于上表面的物镜观测到，同时上表面的细胞也可以通过明场看到（图1b）。为了测量细胞释放分子的分子量，作者通过标定已知质量的几种蛋白获得分子量相对于散射强度的标准曲线（图1c），呈现线性关系，这与散射光的干涉模型吻合。当裂解细胞时，通过测量观测到的分子散射强度，就可以算出每个分子的分子量（图1d）。细胞在裂解后释放出的分子数量为1000个/分钟，远大于未裂解时的分子数（<10个/分钟）（图1e）。该方法最低可测到每平方毫米5个细胞释放出的分子。 图2. 利用抗体特异性测量蛋白复合体和结合动力学。 为了特异性地检测某一种蛋白，作者将流道下表面修饰上抗体（mTOR抗体），并以mTOR复合物为例进行测量（图2a）。mTOR蛋白复合物（mTORC）是一种多组分的蛋白，在细胞能量代谢过程中有重要作用。细胞裂解后，实时观测PSM图像中单分子的亮暗变化，即可获取分子结合或脱离表面抗体的信息（图2b），并通过计数后得到最终结合在抗体上的分子数量。图2c展示了用mTOR抗体修饰的表面相比于对照组有更高的mTOR分子结合能力（图中每一个点为一次测量）。通过对捕获分子的质量分析，得到mTORC的质量约为1-2 MDa。得益于PSM的高时间分辨率和空间分辨率，每一个单分子结合或脱离表面的时间都可以被记录（图2d），通过分析单分子在表面结合的时间长度，可以选择性的过滤掉一些弱相互作用（即非特异吸附），从而提高检测的特异性（图2e）。 图3. 单分子级测量AMPK-mTOR磷酸化信号通路。 PSM无需对样品进行变性处理（如SDS-PAGE）即可分析蛋白，保留了蛋白复合体的完整性。为了说明该特点，作者用PSM对比了SDS处理前后的细胞裂解液，发现经过SDS处理后，分子大小显著减小（图3a-b）。在细胞信号传导过程中，蛋白就是通过与其他分子形成复合体和磷酸化的方式传递信号。对此作者研究了AMPK-mTORC1能量感应信号通路（图3c），通过测量mTORC1复合体中的Raptor蛋白成分和磷酸化后Raptor成分（p-Raptor），来分析葡萄糖和AMPK药物对信号通路的影响 (图3d,f)。单分子测量结果与传统western blot基本一致，进一步证实了PSM对细胞内蛋白测量的可行性（图3e,g）。 总结与展望 作者利用PSM显微镜把免标记单分子成像应用到裂解细胞蛋白的测量，为进一步测量复杂细胞体系单蛋白分子打下基础。该技术未来可与单细胞和微孔阵列相结合，实现单细胞体系中单蛋白的研究。 通讯作者信息 王少鹏教授任职于美国亚利桑那州立大学生物医学工程系和生物设计学院生物电子和生物传感器中心。他的研究兴趣包括构建新型的光学和电化学生物传感器和分析仪器，并应用于生物医学研究、生物标志物检测、药物测量和疾病诊断等。目前研究项目包括：光学测量分子相互作用、细胞活动、细菌抗药性研究，和数字化免疫分析血液中生物标志物等。发表文章过百篇，H指数46。 个人主页： https://faculty.engineering.asu.edu/spwang/
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