ACS Cent. Sci. | 通过酶标记方法实现活细胞内细菌蛋白的超分辨成像

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今天给大家分享一篇最近发表在ACS CentralScience杂志上的文章，Enzymatic Labeling of Bacterial Proteins for Super-resolutionImaging in Live Cells。文章的通讯作者是美国加州理工学院，美国科学院、工程院、医学院三院院士David A. Tirrell教授。Tirrell教授的研究兴趣是将有机化学、生物化学和材料化学结合起来，形成具有可控分子和超分子结构的新型聚合物体系。Tirrell教授对化学最重要的贡献体现在三个方面：1）自由基共聚机理，2）仿生膜化学，3）开发分子生物学方法用于新的高分子材料的研发。

荧光成像技术在生物医学领域起着举足轻重的作用，它可以实现细胞、组织及动物层面的实时观察，但在亚细胞或更小结构的精细观察上受限于衍射极限。近十几年来，超分辨成像技术如受激辐射损耗超分辨成像（STimulated Emission Depletion, STED），光活化定位显微成像技术（Photo-Activated Localization Microscopy, PALM），随机光学重构超分辨成像（STochastic OpticalReconstruction Microscopy, STORM）等的发展打破了衍射极限的局限，为成像领域带来了革命性的突破。[1]其中，PALM和STORM在原理上都属于基于单分子定位显微成像技术（Single MoleculeLocalization Microscopy, SMLM）的超分辨显微成像，其原理是利用不同波长激光调控高度精确定位的单个荧光分子或绿色荧光蛋白质随机发生荧光淬灭态（暗态）和荧光态之间的相互转变，在每1次循环中，视野中绝大部分的荧光探针分子被转换到暗态，只有稀疏少量的荧光分子发生随机活化的荧光发射，这些稀疏发光的荧光分子的图像彼此不会重叠，可以获取这部分荧光分子高度精确的定位，经过多次重复随机的点亮稀疏荧光分子的过程，可以实现大量荧光分子的精确定位，将采集的稀疏分子发光图像进行整合与重建得到高分辨率的显微成像，[2]在该研究中用到的STORM超分辨技术原理如图1所示。简单来讲，PALM和STORM都是利用了荧光染料分子“光控开关”（photo-switchable）或者荧光蛋白的“光控转化”（photo-convertible）性质，达到在一个衍射极限空间内（200~300nm）随机“点亮”单个荧光分子并进行高精度定位的目的（图2）。在STORM技术中，荧光染料的选择是最终成像分辨率的决定性因素之一，常用于这类成像技术的荧光材料包括有机小分子荧光染料（花菁类荧光染料Cy5和Cy7等）、绿色荧光蛋白质和半导体荧光量子点等光致发光材料，其中有机小分子荧光染料易于修饰靶向基团，是最常用的标记染料。

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图1. STORM超分辨原理图。（该图片来源于“北京拓普光研科技发展有限公司：基于单分子定位技术的超分辨显微成像”）

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图2. STORM技术中荧光开关原理图。（该图片来源于“北京拓普光研科技发展有限公司：基于单分子定位技术的超分辨显微成像”）

活细菌细胞内蛋白质的超分辨成像成为原核细胞生物学研究的有力工具。具有光开关性质的有机染料具有超分辨率成像所需的许多光物理特性，包括光稳定性好、亮度高[3]和光子产出高[4]等。但是，许多传统的STORM染料（如Cy5和Alexa 647）需要使用氧气清除缓冲体系和添加外源还原剂来促进光开关效应。[5]它们通常与能找到蛋白质的抗体结合在一起，[6]此类标记实验中使用的抗体大小为10-15nm，这可能会降低单分子成像实验的定位精度。[7]且这种组合使得探针过大，无法穿过细胞膜或干扰蛋白质功能。此外，用于细胞固定和渗透化处理所需试剂也需要小心优化以确保图像质量不受影响。[8]因此，提高探针的标记特异性，即在活细胞靶蛋白中选择性引入具有光开关特性的有机荧光团，是推进超分辨显微术发展的关键和和需解决的瓶颈问题。


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针对上述问题，Tirrell教授团队通过利用真核酶N-肉豆蔻酰基转移酶（NMT)将叠氮脂肪酸引入到E. coli胞内蛋白N端，同时使用细胞膜透过性荧光团，发展了一种化学酶法标记活细胞中细菌蛋白质的一般策略（图3A）。该策略采用真核酶NMT将肉豆蔻酸替代品12-叠氮十二烷酸（12-ADA，1）连接到感兴趣的蛋白质上。同时，细菌靶蛋白配备一个来源于哺乳动物钙调磷酸酶B蛋白的N端九肽序列MGNEASYPL，作为NMT的识别序列。在该项研究中，研究者利用具有细胞膜透过性和光开光特性的罗丹明螺酰胺类染料2和3，实现了对活细菌中趋化性蛋白Tar和CheA与细胞分裂蛋白FtsZ和FtsA的标记，这是该类结构在标记和成像活细菌细胞中特定蛋白质的首次应用。当在405nm处激活时，荧光染料从非荧光态（内酯形式）到荧光态（开环形式）；在极性溶剂中，开环的罗丹明异构体在毫秒内再环化，由荧光态再回到非荧光态，赋予其光开关特性。细菌中趋化性蛋白Tar的超分辨成像显示了一个螺旋状的图像；FtsZ的成像产生了散布在整个细胞内的带状图案（图4A）。这些染料在活细胞成像时每发生一次开关事件就会发射数百个光子（图4B）。另外，重构得到的高分辨率显微图像的横向空间分辨率和轴向定位精度分别接近15和30nm（图4C）。更重要的是，与传统STORM染料不同，该类分子不需要氧气清除缓冲体系和添加外源还原剂促进染料的激活，有利于实现该标记方法在活细胞内细菌蛋白纳米分辨显微成像中的广泛应用。


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图3. 活细胞超分辨成像的设计策略。（A）在靶蛋白表达过程中用1处理细胞，产生叠氮标记蛋白。随后，与含有炔基的细胞膜透过性光开关染料2和3环加成发生点击化学反应，标记靶蛋白用于超分辨成像。（B）脂肪酸1和罗丹明2和3的结构。

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图4. 活细胞中细菌蛋白质的超分辨成像。表达四种细菌蛋白之一的细胞均被1和2标记。（A）大肠杆菌中趋化性蛋白（Tar和CheA）或细胞分裂蛋白（FtsZ和FtsA）的STORM图像。（B）图像采集过程中检测到的光子数量（单指数拟合，蓝色曲线）。（C）活细菌细胞成像的平均径向精度。


文章亮点：

1. 罗丹明2和3的光子产率与商品化荧光染料Atto 655和 Alexa 750相当；

2.罗丹明2和3可直接用于活细胞内蛋白的成像，无需细胞固定和渗透化处理；

3. 该类分子不需要氧气清除缓冲体系和添加外源还原剂促进染料的激活；

4.罗丹明2和3的炔官能团使这些荧光团可广泛用于标记原核和真核细胞中其他叠氮化合物标记的生物分子。

综上，本文报道了一类新的反应活性罗丹明螺酰胺染料，并证明了它们作为细胞膜透过性荧光探针在活细菌细胞超分辨成像中的应用。NMT介导的标记提供了一种简单的策略，可以方便地将结构小的、明亮的、可光开关的染料附加到特定的靶蛋白上。其中，细菌趋化性蛋白Tar和细胞分裂蛋白FtsZ超分辨成像捕获的蛋白质组装的特征信息是受光学衍射极限限制的传统光学显微成像所不可分辨的。本研究拓展了可用于活细胞内蛋白质超分辨成像的方法，并有助于发现新的生物超微结构。

参考文献

1. Sigal Y M,Zhou R, Zhuang X. Visualizing and discovering cellular structures withsuper-resolution microscopy[J]. Science, 2018, 361(6405)0-887.

2. 潘文慧, 李文, 屈璟涵, 等. 单分子定位超分辨显微成像有机荧光探针的研究进展[J]. 应用化学, 2019 (2019 年 03): 269-281.

3. Ulrich G,Ziessel R, Harriman A. The chemistry of fluorescent bodipy dyes: versatilityunsurpassed[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2008,47(7): 1184-1201.

4. Dempsey GT, Vaughan J C, Chen K H, et al. Evaluation of fluorophores for optimalperformance in localization-based super-resolution imaging[J]. Nat. Methods,2011, 8(12): 1027.

5. NahidiazarL, Agronskaia A V, Broertjes J, et al. Optimizing imaging conditions fordemanding multi-color super resolution localization microscopy[J]. PLoS One,2016, 11(7): e0158884.

6. Bates M,Jones S A, Zhuang X. Preparation of photoswitchable labeled antibodies forSTORM imaging[J]. Cold Spring Harbor Protocols, 2013, 2013(6):pdb. prot075168.

7. Huang B,Babcock H, Zhuang X. Breaking the diffraction barrier: super-resolution imagingof cells[J]. Cell, 2010, 143(7): 1047-1058.

8. Whelan, D.R.; Bell, T. D. M. Image Artifacts in Single Molecule Localization Microscopy:Why Optimization of Sample Preparation Protocols Matters. Sci. Rep. 2015,5, 7924.

原文作者：Samuel H.Ho and David A. Tirrell*

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.9b00617

原文引用：https://doi.org/10.1021/acscentsci.9b00617


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