为大家分享的是一篇发表在Science Advances上的文章，通讯作者是来自University of Washington的Xiaohu Gao (高虓虎)。高教授的研究领域有体内分子成像、分子诊断以及靶向药物输运等。本文中作者报告了非共价胆固醇标签，使几乎所有的紧致蛋白质都能渗透到细胞膜中，从而完全绕过内吞作用。这个简单的即插即用平台极大地扩展了蛋白质的生物学应用空间，并具有改变基础生物学研究和药物发现的潜力。

与小分子相比，基于蛋白质的成像剂和治疗剂在结构和功能上更为优越，并且更易于设计或筛选，例如抗体可以很容易地针对几乎任何靶标合成。然而因为大分子无法自发穿过细胞膜，基于蛋白质试剂的作用效果被大大削弱，仅作用于少量的细胞外靶标。蛋白质对胞内的递送主要通过胞吞，这是大自然开发的一种有效的防御机制，防止完整的生物分子进入细胞质，但也限制了常规蛋白质递送技术的应用。为了应对这一挑战，作者在此报告了一种基于非共价胆固醇标签的，独特而简单的解决方案。它使蛋白质直接渗透进细胞膜而不会产生瞬时孔。

图1 通过胆固醇标记的蛋白质的胞质递送

首先，作者测试了多种大小的蛋白质（分子量介于6.5和150 kDa之间），发现这种独特的胞质传递机制对蛋白质大小具有选择性。随着蛋白质大小的增加，通过直接渗透进入细胞的蛋白质的百分比减少，而通过内吞作用进入细胞的蛋白质的百分比增加。例如，分子量为6.5 kDa的抑肽酶显示出明亮而均匀的胞内荧光分布，表明没有内吞作用。相比之下，大蛋白，例如牛血清白蛋白（BSA; 66 kDa）和免疫球蛋白G（150 kDa）仅显示点状细胞内荧光，表明内吞作用是主要的细胞进入机制（图1）。

图2 标签密度对递送途径的影响

随后，作者以不同的分子比例将中等大小的蛋白溶菌酶与胆固醇标签混合在一起（图2A）。在低标签/蛋白质比率下，仅观察到点状细胞内荧光分布。随着比率增加到6，开始出现扩散的荧光信号，表明直接的膜渗透有一些贡献，而摩尔比为8导致蛋白分子大量的直接膜渗透。

为了进一步排除标记的蛋白最初通过内吞作用进入细胞的情况，作者再次在4°C下使用小蛋白抑肽酶进行了共聚焦显微镜实验，这是一个阻止内吞膜运输的温度。没有标签时，抑肽酶被细胞吸收几乎可以忽略不计，而在低标签/蛋白质比率下，抑肽酶实际上被限制在细胞膜上（图2B）。在最佳标签/抑肽酶比率下，在低温下仍观察到明亮且均匀的细胞内荧光，这证实了蛋白质-标签复合物最初并未通过胞吞作用被细胞吸收。

图 3 使用LifeAct-GFP（绿色）在活细胞中标记F-肌动蛋白

接着，作者继续证明了对生物学和医学有重大影响的两种应用：活细胞中的免疫荧光和细胞内治疗性蛋白的递送。如图3A所示，当LifeAct-GFP与胆固醇标签混合时，它不仅进入细胞，而且显示出独特的细丝结构， LifeAct功能性和标记特异性得到保留。相反，单独的LifeAct没有显示任何细胞内标记（图3B）。为了证实标记的特异性，在与LifeAct-Tag孵育之前，先用细胞松弛素D对细胞进行预处理，细丝结构被完全破坏（图3C），证明了在药物反应测试中使用标签技术的可行性。

作者进一步将标签技术与Fuse-It-P（一种融合脂质体，由LifeAct-GFP公司推荐并提供）进行了比较。如图3（A和D）所示，在相同的LifeAct-GFP浓度下，胆固醇标签技术产生了明显更好的对比度。

图4 使用胆固醇标签将Cyt c递送到活的肿瘤细胞中

最后，为了验证在治疗性蛋白质递送中的应用，作者选择了细胞色素c（Cyt c，一种用于细胞凋亡的细胞内信号转导蛋白）作为模型货物分子并用荧光染料（AF488，绿色）标记了它。与对照（未处理）相比，单独用Cyt c处理的细胞显示出较小的点状细胞内绿色荧光，表明微量的Cyt c被细胞摄取，但被内体/溶酶体捕获（图4A）。相反，在Cyt c中添加胆固醇标签会导致强烈的核周荧光，这可能是由于Cyt c与细胞内细胞器（例如内质网）结合，从而启动了凋亡过程。细胞活力研究显示剂量依赖性的细胞死亡（图4B），类似于先前使用微注射Cyt c的报道。

综上，本文作者开发出一种独特的递送方式，可以将成像或治疗性蛋白质直接带入细胞质，而绕过内吞作用。这项简单而强大的技术不仅可以对活细胞中的胞内靶标进行免疫标记以进行动态成像，而且还为蛋白质治疗和细胞工程的开发提供了令人兴奋的机会。

文章作者：HBQ

原文引用：10.1126 / sciadv.abb0310

责任编辑：HBQ

原文链接：https://advances.sciencemag.org/content/6/25/eabb0310