为大家介绍一篇2020年发表在Advanced Science的文章，题目为“Rapid Determination of Antimicrobial Susceptibility by Stimulated Raman Scattering Imaging of D₂O Metabolic Incorporation in a Single Bacterium”。在本研究中，作者开发了一种基于重水（D₂O）代谢标记细菌活性的新型药敏检测方法，可在2.5-3h内获得检测结果。本文通讯作者是美国波士顿大学的Weili Hong和Ji-Xin Cheng

随着抗生素的广泛滥用，细菌耐药性问题日趋严重，而有效的抗生素药敏检测方法（Antimicrobial susceptibility testing, AST）是解决这一问题的关键。纸片扩散法、肉汤稀释法等传统AST方法主要基于细菌的生长增殖等表型进行检测，这类方法通常耗时太久(16-24h)以至于无法及时指导临床疾病的诊断和治疗。而基于基因型的AST方法虽然可快速地提供检测结果，但其存在的问题是不同细菌的耐药机制和耐药基因不同，耐药基因型和表型不一定相符，实用性不强，而且这类方法无法提供最小抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration, MIC）。基于拉曼光谱技术也开发了一些快速的AST方法，这类技术可基于细菌的代谢活性进行药敏检测，在抗生素的作用下，向细菌培养基中添加带有氘的物质（如重水（D₂O）或氘-葡萄糖（glucose-d₇）），细菌通过代谢便会将D₂O 或glucose-d₇中的氘结合到细菌中，形成C-D键，C-D键可通过拉曼散射技术进行检测，经过分析便可定量不同抗生素浓度下细菌的代谢活性，最终获得细菌的抗生素敏感性或MIC。但拉曼光谱普遍存在信号弱的问题，这大大影响了其检测的灵敏度^[1-3]。

基于受激拉曼散射（SRS）或相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）的相干拉曼显微镜通过将激发能量聚焦于目标拉曼波段可以使信号得到数量级地增强。之前作者已开发了一种基于氘-葡萄糖（glucose-d₇）标记-受激拉曼散射成像（SRS imaging）的快速AST，细菌通过代谢将glucose-d₇中的氘结合到细菌中，形成C-D键，C-D键可通过受激拉曼散射技术进行检测成像，经过分析便可获得细菌的抗生素敏感性和MIC^[3]。但由于glucose-d₇本身就自带C-D键，会造成背景干扰，降低了信噪比，因此影响检测结果的准确性和灵敏性。而在本研究中，作者将glucose-d₇换成了重水（D₂O），开发了一种基于D₂O标记- SRS imaging的快速AST方法，D₂O本身不含C-D键，因此无背景干扰。研究人员在培养基中添加D₂O与细菌进行共培养，细菌代谢的过程中将D₂O中的氘结合到细菌的脂肪酸、蛋白质等物质上形成C-D键，再用飞秒脉冲受激拉曼散射技术进行检测成像，成像时间只需1.2秒/图像。作者确定了D₂O的最适浓度为70%，实验结果显示随着培养时间的增加，C-D信号强度逐渐增强，说明该方法可用于定量检测细菌的代谢活性。

为了进一步验证D₂O代谢标记- SRS imaging方法能否用于检测抗生素对细菌代谢活性的影响。研究人员首先选取了一株对庆大霉素（gentamicin）敏感、对头孢噻肟（cefotaxime）耐药的P. aeruginosa作为研究对象，分别添加庆大霉素和头孢噻肟进行培养，再通过SRS imaging检测细菌在不同抗生素作用下代谢活性的变化。检测结果显示可准确反映P. aeruginosa对不同抗生素的敏感性，表明该方法可用于快速AST检测，区分耐药与敏感的cut-off值被设定为C-D radio=0.6（图2）。

图2 通过D₂O代谢标记- SRSimaging检测抗生素对细菌代谢活性的影响

接着，作者进一步考察了此方法是否能够得到准确的MIC值。以P.aeruginosa、S. aureus作为研究对象。将过夜培养的细菌与梯度稀释的抗生素共培养在新鲜的cation-adjusted Mueller–Hinton broth（MHB）培养基中，1h后再加入70% D₂O，并再次加入相应浓度的抗生素以维持抗生素的初始浓度，培养0.5h后，进行离心清洗，并进行SRS成像和分析（图3a）。结果显示对于某种抗生素敏感的细菌其C-D信号会随抗生素浓度的增加而减少，且信号会在MIC浓度处显著下降（图3b-3f）。此外，该结果与传统的肉汤稀释法获得的MIC也具有较好的一致性。

图3 基于D₂O代谢标记- SRSimaging的快速AST检测MIC

为了验证该方法是否具有普适性，研究人员测试了临床上常见的8种细菌和14种抗生素，共37组菌药组合。随后将检测结果与传统的肉汤稀释法进行比较，结果显示MIC值有94.6%的准确，5.4%的最小偏差且无较大偏差和重大偏差，该结果符合FDA对AST检测准确性的要求（表1）。此外，研究人员还尝试将此方法用于临床样品的AST检测。分别将E. coli和P.aeruginosa加入尿液和血液中。检测结果表明该方法与传统的肉汤稀释法获得的MIC具有较好的一致性，可直接用于尿液样品和血液样品的AST检测。

表1 基于D₂O代谢标记- SRS imaging的快速AST法与肉汤稀释法获取的MIC结果的比较

总结：作者基于重水代谢标记-受激拉曼散射成像方法可准确检测细菌代谢活性的原理，开发出一种新型的抗生素药敏检测方法。该方法可快速（2.5-3h以内）且较准确地获得药敏检测结果，而且可应用于尿液和血液样品的药敏检测，是一个有临床应用前景的快速药敏检测方法。

[1]    Tao, Y.; Wang, Y.; Huang, S.; Zhu, P.; Huang, W.; Ling,J.; Xu, J. Metabolic-activity-based assessment of antimicrobial effects by D₂O-labeledsingle-cell Raman microspectroscopy. Anal.Chem, 2017, 89(7), 4108-4115.

[2]    Hong, W.; Karanja, C. W.; Abutaleb, N. S.; Younis, W.;Zhang, X.; Seleem, M. N.; Cheng, J. Antibiotic susceptibility determinationwithin one cell cycle at single-bacterium level by stimμlated Raman metabolicimaging. Anal. Chem, 2018, 90(6), 3737-3743.

[3]    Yang, K.; Li, H.; Zhu, X.; Su, J.; Ren, B.; Zhu, Y.;Cui, L. Rapid antibiotic susceptibility testing of pathogenic bacteria usingheavy-water-labeled single-cell Raman spectroscopy in clinical samples. Anal. Chem, 2019, 91(9), 6296-6303.