成像质谱流式细胞术 (IMC) 已迅速发展成为组织切片高维分析的主流技术。但是，激光烧蚀的速度慢，成像0.25mm²的区域需要3.5h，不利一般的临床应用。免疫荧光显微镜 (IFM) 是先根据几种生物标志物定位目标区域（ROI），然后在另一个连续切片上用金属标记的抗体染色，再进行IMC多重分析。然而，连续切片的差异不可避免地导致空间定位不准确。

如果通过开发荧光和质谱双模态探针成为了一种解决方案，它可以使用IFM进行快速扫描以定位 ROI（每小时500mm²），最大限度地减少IMC采集过程中盲扫的浪费时间，提高分析的空间精度。同时，IFM能够以纳米分辨率对具有详细空间分布的功能蛋白质进行可视化。

荧光碳点已被报道作为廉价的荧光成像探针，由于Cdots表面有丰富的羟基、羧基和醛基，很容易和小寡核苷酸配体（适体）、肽或抗体等形成共轭。因此，Cdots成为荧光成像、药物治疗的理想材料。和商业镧系元素同位素螯合聚合物质谱标志物 (MCP(Ln))相比，可修饰的碳基材料拓宽了分子探针和亲和试剂的类型。

有鉴于此，上海交通大学沈广霞和丁显廷教授合成并纯化了一系列镧系元素掺杂的多色荧光碳纳米点 (MC-Cdots(Ln)) 作为双功能标签。经色谱纯化后与NH2-适体偶联形成B/G/R-Cdots(Ln)-适体，作为双功能探针。然后将MC-Cdots(Ln)-aptamers 探针进一步与市售 Maxpar 金属标记抗体复用，实现利用荧光信号的 IFM 对 ROI 的快速识别，然后在同一组织切片上与IMC进行原位ROI的多重检测。

相关成果以“Aptamer Probes Labeled with Lanthanide-Doped Carbon Nanodots Permit Dual-Modal Fluorescence and Mass Cytometric Imaging”为题发表在 ADVANCED SCIENCE 上。

作者首先在DMF中使用镧系离子溶剂中与柠檬酸 (CA) 和尿素的氧原子配位，然后立即将混合物碳化以形成稳定的 MC-Cdots(Ln)，之后又通过不同洗脱时间的尺寸排阻色谱 (SEC) 纯化 MC-Cdots(Ln)，获得蓝色、绿色和红色发射荧光组分，命名为 B-Cdots(Ln)、G-Cdots(Ln) ) 和 R-Cdots(Ln)。相对PL量子产率分别达到42.6%、8.82%和6.92%。此外，不同的镧系元素被掺杂到Cdots中以形成双模态标签库。合成了镧系元素掺杂的蓝色、绿色和红色 Cdots（即B-Cdots(Ln1)、G-Cdots(Ln2) 和R-Cdots(Ln3)），具有功能性羧基，然后与NH2-aptamers通过酰胺反应形成B-Cdots(Ln1)-aptamer1、G-Cdots(Ln2)-aptamer2和R-Cdots(Ln3)-aptamer3 双功能探针。

作者使用钬(165Ho) 作为模型镧系元素，B-Cdots(165Ho)、G-Cdots(165Ho)和R-Cdots(165Ho)的透射电子显微镜(TEM)图像显示出均匀且窄的尺寸分布，平均直径约为1.8、3和4.9 nm，晶格参数分别为0.24和0.34 nm，对应于（002）和（100）晶格平面。纯化部分的逐渐增加的大小与红移的 PL 波长一致，这源于量子限域效应。

尿素和柠檬酸不仅作为MC-Cdots(165Ho)的碳源，而且还用于通过氧原子与镧系元素螯合形成稳定的镧系元素掺杂碳材料。为了测试制备其他镧系元素掺杂碳材料的制备方案的通用性，作者还将其他七种不同的镧系元素离子，Ho³⁺、Tb³⁺、Tm³⁺、Ce³⁺、Lu³⁺、La³⁺和Pr³⁺ , 用于制备 MC-Cdots(Ln)。

图1. (a) MC-Cdots(Ln)的合成和表征。

以MC-Cdots(165Ho)为例，XPS谱证实了其表面上存在羧基，可以通过酰胺键与含胺基团的分子共价连接。随后，B-Cdots(165Ho) 通过与 A10-3.2 适体结合针对 PaC 细胞系的 PSMA 抗原进行评估。B-Cdots(165Ho)双模标签与-NH2C7修饰的A10-3.2适体的缀合通过（EDC-NHS）共价化学进行，结果表明-NH2C7-A10-3.2的基本结构在与B-Cdots(165Ho)共轭时没有改变。为了进一步确定 B-Cdots(165Ho) 与适体分子的成功连接，作者使用质谱流式细胞术 (CyTOF) 的溶液模式测量来测量 B-Cdots(165Ho)-A10-3.2 探针的金属165Ho信号，Ho信号强度与B-Cdots(165Ho)-A10-3.2探针浓度范围为0.2-10×10-9m之间存在线性回归。进一步进行分子探针滴定以验证和检查B-Cdots(165Ho)-A10-3.2分子探针的特异性和亲和力，结果表明，B-Cdots(165Ho)-A10-3.2探针与靶细胞的非特异性结合极少。

图2. B-Cdots(165Ho)-A10-3.2的合成和验证。 

作者接着验证 B-Cdots(165Ho)-A10-3.2 的双重功能，对人LNCaP（PSMA 阳性细胞系）和PC-3（PSMA 阴性细胞系）细胞进行了染色实验，表明B-Cdots(165Ho)-A10-3.2有效的特异性靶向能力。通过IMC进一步扫描载玻片上的 Cdots(165Ho)-A10-3.2染色细胞，B-Cdots(165Ho)-A10-3.2染色的LNCaP细胞表达高水平的荧光和质量信号。从阴性对照PC-3细胞中未检测到或几乎没有荧光和质量信号。

图3. 靶向 LNCaP 和 PC-3 细胞的 B-Cdots(165Ho)-A10-3.2 探针可实现来自 IFM 和 IMC 的双信号检测。

然后作者又扩展了基于适体的分子探针以形成双功能探针库，SYL3C和AS1411是基于DNA的适体，可与 EpCAM 和 NCL 特异性结合。分别使用B-Cdots(165Ho)-SYL3C和B-Cdots(165Ho)-AS1411适配体标记LNCaP细胞的EpCAM（I 型跨膜蛋白，它在大多数癌细胞表面过度表达，并参与细胞粘附和细胞信号传导）和NCL蛋白，并使用IFM和IMC研究EpCAM和NCL的分布。IFM以光学分辨率为这些功能蛋白质提供了更详细和准确的空间分辨率，补偿了IMC成像的低分辨率。B-Cdots(159Tb)-A10-3.2、G-Cdots(165Ho)-AS1411 和 R-Cdots(169Tm)-SYL3C适配体并证明了三种生物标志物同时具有高分辨率和特异性的成像。。

图4. 与IMC相比，IFM 提供了更详细的生物标志物空间分布。

接着作者将合成的B-Cdots(159Tb)-A10-3.2、G-Cdots(165Ho)-AS1411 和 R-Cdots(169Tm)-SYL3C双功能探针与传统的 Maxpar X8 金属标记抗体混合用于进一步分析人类福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)PaC组织。

通过IFM的平铺扫描模式记录了PaC组织切片的3.5 mm×3.5 mm区域的荧光图像，扫描过程在180秒内快速完成（通常需要150h，节约90%时间）。

如图5a所示，PSMA阳性上皮细胞在IMC图像中的分布与IFM图像中观察到的分布一致。进一步利用histoCAT通过热图分析PSMA和α-SMA强度分布。热图通过拓扑信息量化了PSMA和α-SMA的表达水平(图5g,h)。159Tb和158Gd通道的热图显示，金属探针特异性靶向PaC组织上的前列腺腺泡上皮细胞和间质细胞。从histoCAT中提取图像衍生的生物标志物强度结果表明，与PaC组织切片上的其他癌症生物标志物相比，PSMA含量显著过表达。

图5. FP-CD的防伪和图形加密应用。

最后，作者进一步分析了从五个不同的ROI收集的目标图像。不同ROI的159Tb通道热图表明合成的B-Cdots(159Tb)-A10-3.2探针特异性靶向不同ROI的前列腺腺泡上皮细胞（图6a），并表明探针具有所需的稳定性。此外，PSMA和EpCAM的散点图表明表达水平呈线性相关。

图5.  PaC 组织切片高维图像中细胞亚型的 histoCAT 分析。

文献链接：

https://doi.org/10.1002/advs.202102812