为大家分享一篇发表在JACS上的文章，文章的题目是“Nanopore Detection Using Supercharged Polypeptide Molecular Carriers”，通讯作者是来自伦敦帝国理工的Joshua B. Edel和Aleksandar P. Ivanov，德国莱布尼兹材料研究所的Andreas Herrmann教授，其中Edel教授的实验室专注于单分子检测等生物分析传感器的开发。

蛋白质组学技术已经广泛应用于药物靶点鉴定和生物标志物的开发，但蛋白质组学研究严重依赖于质谱，通常需要较大量的蛋白才能进行可靠的表征，因此该技术不太适用于低拷贝数的蛋白。相比之下，基于纳米孔的单分子检测技术更适合于微量蛋白的实时检测，通过将靶蛋白穿过纳米孔引起的电位变化即可完成检测，然而如何精准控制靶分子穿过纳米孔仍是充满挑战的。现有的策略是使用充分带电的载体（如DNA，带电多肽）来帮助蛋白穿孔。最近的研究中已有研究者使用DNA作为载体来控制靶肽穿过纳米孔，但该方法仍依赖于复杂的DNA-多肽连接，且仅适用于短肽。因此本文中作者希望使用带电、不带二级结构的多肽(Supercharged unstructured polypeptides, SUPs)来替代DNA作为载体，以精准控制靶蛋白穿孔的过程。

作者从天然的弹性蛋白elastin的序列中参考合成了SUPs，其由一个(VPGXG)n的五肽重复单元组成，其中X为可变AA，可以为带电或不带电的AA，通过编码X和n即可获得不同长度和电荷的SUPs，再通过融合表达就可以将SUPs整合在靶蛋白上。在本文中作者使用eGFP作为模型蛋白，该蛋白由于较小的分子量和刚性的β-barrel结构导致难以使用固态纳米孔解析。作者分别在eGFP上融合了带有正电的SUP(X=K)和负电的SUP(X=E)，这几种eGFP变体具有不同的等电点，因此使用不同的外加电压就可以区分不同的eGFP。结果显示相同的外加电压下，eGFP-E36和eGFP-K36具有比WT好数十倍的捕获率，此外两者在纳米孔内的滞留时间也有增加，而这对提高测序的分辨率和检测率具有很重要的意义。

接下来作者合成带有不同正电数的eGFP-K，结果也显示随着更多正电荷的引入，eGFP具有更高的捕获效率和更多的停留时间，作者最后筛选出了eGFP-K72作为潜在的载体。作者还比较了SUPs与传统的载体dsDNA，结果显示SUPs能提供更久的滞留时间。此外作者设计了不同大小和形状的蛋白作为靶蛋白测试了K72的性能，都获得很高的捕获率。作者还为了消除K72随机折叠带来的假阳性，合成了K36-SfGFP-K36。

最后作者使用该系统尝试检测了eGFP及其抗体的相互作用，结果显示相比于WT的GFP-抗体复合物，带有K72的复合物能以更慢的速度通过纳米孔，从而得到与仅存在抗体时完全不同的pattern图。

总之，本文作者证明了富电荷非结构化多肽可用于充分控制通过纳米孔的蛋白质转运。