极性的磷酸化代谢物，如糖磷酸盐、磷酸羧酸和核苷酸等，参与多种生物过程，包括能量转换、辅因子再生、核酸合成等。这类磷酸化代谢物的鉴定与定量分析对于破译它们在多种代谢途径中的生物学功能非常重要。目前基于LC-MS或GC-MS的分析方法受限于这类化合物的化学稳定性与检测灵敏度，且由于这类化合物的低电离效率以及来自样品基质的离子抑制，极性磷酸化代谢物的分析仍存在挑战。最近，武汉大学化学与分子科学学院的袁必锋教授课题组在Analytical Chemistry上发表了以“Chemical Tagging Assisted Mass Spectrometry Analysis Enables Sensitive Determination of Phosphorylated Compounds in a Single Cell”为题的文章。在该研究中，他们合成了一对轻、重同位素标记试剂——DMPI与d3-DMPI，可以有效且高选择性地与极性磷酸化代谢物中的磷酸基团发生反应（图1，上方）。图1 DMPI、d3-DMPI与核糖核苷酸反应以及衍生前（A）、后（B）核糖核苷酸的提取离子色谱图。
DMPI的吲哚杂环基团中带有两个叔胺基团，可以提高LC-MS/MS分析中标记产物的电离效率。经DMPI衍生，核糖核苷酸的检测灵敏度提高了25~1137倍，是目前质谱分析中能达到的最高水平。此外，DMPI标记还提高了核糖核苷酸在反相柱上的保留能力与分离度（图1，下方）。基于此，他们绘制了标准曲线以实现核糖核苷酸的定量分析，日内及日间的RSD均小于15.1%且相对误差小于15%，表明该方法具有良好的精密度和准确度。他们将开发的DMPI/d3-DMPI标记策略结合LC-MS/MS分析，应用于单个Hela细胞中核糖核苷酸的检测。单个HeLa细胞的裂解物用DMPI进行标记，以d3-DMPI标记的核糖核苷酸作为内标。基于该方法，在单个HeLa细胞中检测到了12种核糖核苷酸，且定量结果与此前从大量细胞得到的数据相当。这一结果表明，DMPI/d3-DMPI标记策略是研究特定条件下单细胞中极性磷酸化代谢物动态变化的有力工具。此外，他们还进一步应用开发的方法来检测拟南芥单个雄蕊中的内源性核糖核苷酸，并探究高温对拟南芥单个雄蕊中核糖核苷酸水平的影响。在高温胁迫下，拟南芥雄蕊的生长受到了抑制，且其内源性核糖核苷酸的水平显著降低，这说明核糖核苷酸的水平与植物繁殖过程有关，且在植物对非生物胁迫的响应中起重要作用。这是对拟南芥单个雄蕊中核糖核苷酸水平的首次报道。总之，本研究合成了DMPI和d3-DMPI的轻、重同位素标记试剂，并将DMPI/d3-DMPI标记策略与LC-MS/MS分析相结合来检测极性磷酸化代谢物。此方法可以促进哺乳动物和植物的微小器官或组织内极性磷酸化代谢物的功能及其调节网络的相关研究。除了本研究中展示的核糖核苷酸，他们未来还拟将该方法将用于其他磷酸化代谢物的分析检测并助力单细胞代谢组学研究。
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