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文章题目:Combining Isotopologue Workflows and Simultaneous Multidimensional Separations to Detect, Identify, and Validate Metabolites in Untargeted Analyses
作者简介:
Gary J. Patti, Departments of Chemistry and Medicine, Siteman Cancer Center, Center for Metabolomics and Isotope Tracing, Washington University. (http://pattilab.wustl.edu/members.php)
Erin S. Baker, Department of Chemistry, North Carolina State University. (https://bakerlab.wordpress.ncsu.edu/)
代谢组学作为组学的一个分支,旨在通过分析代谢物的变化来了解生物系统中的代谢表型。代谢组学实验通常有两个重要的目标:1. 鉴定与特定表型(如疾病状态)相关的生物标志物;2. 阐明特定生物学过程(如疾病的进展过程)的代谢路径。要达到这两种实验目的,最好使用广泛地非靶向分析方法,该方法可以在没有确定目标化合物的前提下尽可能多地检测存在于生物样本中的代谢物。非靶向代谢组学的实验流程越来越成熟,但是目前还没有一个统一的方法可以对单个实验中的所有代谢产物的化学和结构的多样性进行表征。同位素标记法可以用来验证筛选得到的标记物是否来源于体内代谢,通常使用13C或15N来标记能量物质来进行实验,包括代谢通路分析、代谢流分析以及其他实验。使用同位素标记的营养物质(通常为13C葡萄糖)来代替12C的摄入,这样就将13C标记引入中间代谢物和副产物中。然后将样本进行提取,使用MS或NMR进行分析,就可以清晰地判定哪些化合物来自生物系统而非实验引入或化学噪音。
同位素标记法可以帮助我们确定与代谢变化相关重要特征,但是这些特征必须在后续实验中进行注释和验证以达到最终鉴定的目的。本文作者将同位素标记方法与LC-IMS-CID-MS法相结合对生物样本进行分靶向分析,鉴定其中的代谢特征。
实验流程如上图所示:1. 两组相同的大肠杆菌在含有同位素标记的葡萄糖的M9盐中培养。 在 OD600 读数为 0.7 时收集大肠杆菌培养物并进行冻干干燥;2. 使用 乙腈/甲醇/水(2:2:1)系统提取代谢物,干燥后,以 40 μL/mg 颗粒的比例用乙腈/水(1:1)系统复溶,然后装入样品瓶中进行分析。将不同比例(1:1 或 1:2)的12C/13C进行混合,以改善峰提取效果。
上图展示了使用 LC-IMS-CID-MS 表征潜在同位素标记体特征的具体流程:1. 观察质谱图中12C和13C的丰度比是否与方法中样本的混合比例吻合(A),为提高准确性,作者还对单独的12C和13C样本进行分析(B),进一步证明质谱信号的生物学来源;2. 利用每个同位素之间的质荷比差异来确定C原子个数(C),结合精确分子量为每个信号生成可能的分子式;3. 对每一个同位素标记的信号进行峰提取,确定它们具有相似的峰形和保留时间(D);4. 由于同位素取代物仅分子量不同,大小是相同的,所以12C 和 13C 分析物的 IMS 漂移时间值几乎相同,因此,两种分析物通过 IMS 漂移池时具有相似的漂移时间(E)。
IMS的使用可以帮助我们对色谱共流出的化合物进行解卷积。如上图所示,A图为大肠杆菌样本的基峰离子流图;B图为保留时间在3-5分钟的共流出化合物的质谱信号,如果仅通过观察同位素的丰度比值对于质谱信号解卷积会有一定的难度,如果结合IMS的漂移时间或CCS值则有助于对同位素信号进行快速标记(C)。D和E所示,没有同位素丰度比例和漂移时间对的信号将被排除。
然后作者利用串联质谱信息、漂移时间、CCS值等信息对筛选之后的信号(包括色谱共流出、同分异构体信号等)进行了归属和鉴定。本文所使用的同位素标记结合LC-IMS-CID-MS法为非靶向代谢组学中的化合物的分析提供了四个维度(LC、IMS、MS、和MS/MS)的信息,说明了IMS在代谢物表征时可以提供空间分离从而提高鉴定的可信度,也为同位素标记质谱实验提供了新的方向。
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