一作：Austin B. Moyle

通讯作者：Michael L. Gross

【背景介绍】

蛋白质足迹质谱是一种新兴的用于研究蛋白质高级结构的技术，可以进一步通过发展新型的共价偶联方法扩展。蛋白质中含有羟基的侧链氨基酸基团在生物系统中扮演者重要角色，而目前的表征方法对于位点的选择性较差，同时对微环境的依赖性较强，因此亟需发展一种方法克服上述问题。本文围绕着上述问题，基于苯甲酰的转移反应发展了一种共价标记方法，结合质谱方法可以实现蛋白质羟基氨基酸的分析。

图1. 含羟基氨基酸作用机理。

【工作创新点】

• 发展了一种新型标记方法，可用于蛋白质带羟基氨基酸的表征。

【结果与讨论】

1. 1.   方法验证

利用氟化物辅助标记蛋白质，并用于足印质谱研究的趋势已经逐渐显现。苯甲酰氟是一种常见、廉价、广泛使用的物质，在适当的条件下可与蛋白质发生酯交换反应，生成酯类化合物，产生氟化氢（如图1所示）。由于酯键的形成，原本蛋白质会附带一个苯甲酰基的质量，从而在质谱中的碎片峰中有所不同。图2分别对应不同当量下多肽中结合不同数量苯甲酰所对应的碎片信息，可以表明多肽中存在羟基氨基酸的数量，并可通过进一步的碎片分析了解具体的结构信息。

图2. 不同当量对应多肽的碎片离子峰。

1. 2.   不同氨基酸种类的分辨

在验证了方法的可行性后，作者对生物素上存在的羟基氨基酸进行了位点分辨的质谱分析，如图3所示。生物素链中存在五个羟基氨基酸，分别位于27，43，45，88，90。作者通过12当量的苯甲酰氟与之反应，观测后续的实验结果。通过液相色谱与质谱联用技术，可以将链中所有氨基酸分辨，确认其是一种有效研究蛋白质的策略。

图3. 不同氨基酸种类的分辨。

1. 3.   亲和素的研究

    从苯甲酰氟的结构不难推测其标记蛋白后会对蛋白质本身的结构造成一定影响，因此作者研究了两种底物在于蛋白质结合前后苯甲酰氟对其作用位点的影响，可以看出该方法具有较好的选择性。

图4. 苯甲酰氟对两种底物-亲和素（Apo和Holo）的位点选择性。

【结论】

综上所述，利用苯甲酰氟作用交换剂，发展了一种高效、良好选择性的足印质谱方法，可以研究蛋白质侧链中含羟基氨基酸。