DNA 中的甲酰基嘧啶对于更好地理解表观遗传学至关重要。尽管已经探索了许多技术来检测它们的含量，但由于当前方法的灵敏度相对较低或缺乏选择性，仍然需要更准确的方法来测定甲酰基嘧啶。在此，提出了一种基于(2-苯并咪唑基)乙腈的叠氮衍生物(azi-BIAN)和5-甲酰基尿嘧啶(5fU)的醛基共价键合的电化学方法，用于高灵敏度检测5fU。首先用 azi-BIAN 处理含有 5fU 的目标 DNA，然后用 DBCO-PEG4-Biotin 孵育，通过无铜点击化学引入生物素基团。接着，巯基通过T4多核苷酸激酶催化反应连接到上述DNA的5'端。随后，标记的DNA通过Au-S键组装到AuNPs修饰的玻碳电极（AuNPs/GCE）上，通过生物素和链霉亲和素之间的特异性识别，链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物（SA-HRP）进一步固定在上述电极表面。最后，HRP 催化对苯二酚氧化为苯醌以增强电流信号，这与核酸中 5fU 的含量有关。该方法与 0.1 ~ 10 nM 的 5fU 浓度具有良好的线性关系。此外，还成功检测了 γ 辐照核酸中 5fU 的水平。

核酸中除了5个基本碱基外，还有许多天然修饰的碱基，如DNA中胞嘧啶的甲基化修饰，极大地丰富了表观遗传学的信息内容，引起了研究人员的广泛关注。目前的研究表明，这些经过特殊修饰的碱基参与了广泛的生物过程，包括基因调控、细胞分化、胚胎发育和基因组印记。这些修饰碱基在不同组织和细胞中的含量可能具有细胞类型特异性。异常的基础水平通常与多种人类疾病有关，尤其是在癌症方面。

由于5fU的丰度低，加上5fC和AP位点的干扰，都与5fU具有相同的醛基，5fU的检测面临着巨大的挑战。到目前为止，已经开发出一些具有代表性的5fU检测方法，包括液相色谱结合电喷雾串联质谱/质谱（LC-ESI-MS/MS），荧光分子标记和富集测序。在这些方法中，LC-ESI-MS/MS分析和荧光标记的目的是在全球层面对5fU进行定性和定量检测，而富集测序主要关注5fU在全基因组范围内的具体位置，无法量化其具体数量。电化学检测具有灵敏度高、性价比高、携带方便、操作简单等优点，在生物样品、化学物质等多种分析物的测定中占有非常重要的地位。在过去的几十年中，已经构建了多种电化学方法来检测基于各种识别元素的不同碱基修饰，这些识别元素通常由抗体、蛋白质和分子组成，具有多种信号放大策略。电化学检测与LC-MS在特殊碱的测定方面相比，前者只需少量的样品，甚至低至几十皮克，即可实现有效检测，无需在预处理中降解核酸，可大大降低样品消耗。

基于上述讨论，作者提出了一种通过差分脉冲伏安法 (DPV) 高选择性检测 5fU 的新型电化学方法。含有 5fU 的靶 DNA 首先通过 azi-BIAN 在 5fU 处与 DBCO-PEG4-Biotin 连接，然后通过 T4 PNK 催化反应在其 5' 端用巯基修饰。最后，标记的 DNA 通过 Au-S 键组装到 AuNPs/GCE 表面，然后被 SA-HRP 识别以催化氢醌氧化。该方法不仅利用电化学传感来提高检测灵敏度，而且利用azi-BIAN对5fU的特异性识别，避免了5fC位点的干扰。此外，利用基于 T4 PNK 的末端标记还避免了核酸中序列的限制，这在一般的基于捕获探针的方法中很常见。该方法具有较高的选择性和相对较低的检测限，可用于检测 γ 辐照核酸和提取的 gDNA 中的 5fU，这意味着该电化学方法具有成为选择性和灵敏检测平台的潜力。生物样品中的 5fU。

电化学检测原理

这种电化学检测的原理如图 1所示。首先，含有 5fU 的目标 DNA 在温和条件下与 azi-BIAN 充分反应，随后与 DBCO-PEG4-Biotin 一起孵育，通过无铜点击化学引入生物素基团。接下来，巯基通过T4 PNK催化反应连接到上述DNA的5'端，将γ-硫代磷酸酯从ATP-γ-S转移到DNA或RNA的5'端。之后，标记的 DNA 通过 Au-S 键组装到 AuNPs/GCE 表面，然后使用两种不同的封闭试剂 MCH 和 BSA 依次封闭非特异性位点。MCH是一种非电活性烷基硫醇，其末端巯基可以通过Au-S键与AuNPs/GCE结合，阻断非特异性活性位点，使位于电极表面的核酸笔直向上。然而，MCH 对 AuNPs/GCE 的阻断作用是有限的，尤其是面对一些大分子的蛋白质，如本工作中使用的 SA-HRP。为避免SA-HRP过度吸收导致的假阳性结果，还使用BSA阻断非特异性活性位点。BSA是一种无催化氧化活性的惰性球状蛋白，可通过机械堆积和吸附与AuNPs表面有效结合。此外，BSA中的游离巯基还可以帮助BSA与AuNPs表面结合，从而彻底覆盖非特异性位点，减少SA-HRP在AuNPs/GCE表面的吸收。封闭后，SA-HRP通过SA与生物素的特异性识别进一步固定在修饰电极上。最后，HRP 催化对苯二酚氧化为苯醌以放大电流信号，并采用 DPV 记录响应。电流信号随5fU浓度的增加成比例增加用于5fU定量检测。

图1. 检测原理

AuNPs/GCE的形态特征

图2A 显示了 AuNPs/GCE 表面的 SEM 图像。它表明直径约为 100 nm 的相对均匀的金纳米团簇被有效地修饰到 GCE 表面上。AuNPs不仅促进了氧化还原过程电子转移，而且还为固定更多分析物提供了大的表面积，从而提高了分析性能。此外，目标可以通过 Au-S 键与 AuNPs/GCE 结合。1 μM 巯基修饰的 ODN 固定前后 AuNPs/GCE 表面的 AFM 图像如图 2所示，在 ODN 修饰的 AuNPs/GCE 表面上可以观察到比在原始表面上更明显的球状的形态，表明 ODN 的成功组装。同时，XPS 还用于验证 Au-S 键的存在，以确保 ODN 末端的巯基修饰和 ODN 固定在 AuNPs/GCE 表面上。

图2. 不同修饰的电极扫描电镜

标记的 ODN 的表征

变性 PAGE 分析用于表征具有不同碱基修饰的标记 ODN。结果如图3所示A（左），相对位置与其分子量有关；标记的ODNs分子量越大，电泳速度越慢。泳道 1、2 和 3 代表未处理的 ODN-5fU、用 azi-BIAN 处理的 ODN-5fU（表示为 ODN-azi-biaU）和用 azi-BIAN 和 DBCO-PEG4-生物素处理的 ODN-5fU （表示为ODN-生物素-U），分别。泳道 4、5 和 6 分别代表与泳道 3 中的 ODN-5fU 相同处理的 ODN-T、ODN-5fC 和 ODN-AP 位点。从泳道1和泳道2可以看出，ODN-5fU与azi-BIAN反应后的电泳速度比原ODN-5fU慢；这是因为前者的分子量较大，说明 5fU 与 azi-BIAN 偶联成功（相关反应式如图 3所示）一个，对的）。泳道3显示ODN-Biotin-U与ODN-azi-biaU相比，与DBCO-PEG4-Biotin孵育后电泳速度进一步下降，同样表明叠氮基与DBCO反应成功。泳道 5 和 6 显示与 ODN-5fU 相同的反应后 ODN-5fC 和 ODN-AP 的位置与泳道 4 中的 ODN-T 相比没有变化，表明 5fC 和 AP 位点未能与 azi-BIAN 缀合。综上所述，上述处理过的ODNs的不同位置表明，只有5fU可以选择性地与azi-BIAN结合并进一步与DBCO-PEG4-Biotin反应，5fU被5fC或AP位点取代不会干扰5fU的选择性标记。尽管它们具有相似的化学结构，但与 azi-BIAN 是一致的，这与之前的报告一致。MALDI-TOF-MS 分析也用于表征缀合反应。结果如图3B所示。表明用azi-BIAN处理后ODN-5fU的分子量增加了265.5， 对应于作者之前计算的265.3的重量，这表明5fU和azi-BIAN的结合成功。此外，ODN-azi-biaU 在与 DBCO-PEG4-Biotin 和 T4 PNK 酶进一步反应后同样进行 MALDI-TOF-MS 分析且其分子量依次增加 749 和 96.6，与计算值 749.9 和 96.0 非常吻合，表明无铜点击化学和 T4 PNK 催化反应的成功发生。总之，每一步分子量的增加与计算值非常吻合，说明每一步化学反应成功。

图3.DNA修饰的每步的效率分析

电化学检测的可行性

CV用于表征修饰电极，相循环伏安图如图4A所示。在AuNPs/GCE上显示了一对[Fe(CN) 6 ] 3-/4-的显着氧化还原峰（曲线 a），但在标记的 ODN-5fU 固定在 AuNPs/GCE 表面后，峰值电流略有下降（曲线 b）。ODNs对[Fe(CN) 6 ] 3-/4-的静电排斥阻碍了电子转移，表明ODNs成功组装到AuNPs/GCE表面，并在T4 PNK的催化作用下修饰了上述ODNs 5'端的巯基。依次与 MCH 和 BSA 孵育后，由于 MCH 和 BSA 的阻断作用，修饰电极的峰值电流显降低（曲线 c 和曲线 d）。当 SA-HRP 被引入修饰电极时，峰值电流不断减小（曲线 e），表明 SA-HRP 成功地固定在电极表面上。EIS还用于监测修饰电极的制造。一般来说，奈奎斯特图的半圆直径，指的是电子转移电阻（Ret )，随着分子在电极表面的连续引入而逐渐增加，表明每个步骤的电极已经成功组装。进一步采用 DPV 验证所提出方法的可行性，相应的差分脉冲伏安图如图4B 所示。曲线 a 和曲线 b 表示用标记的 ODN-5fU 固定的修饰电极和对照的不同电流响应，分别在与 SA-HRP 孵育并在 1 mM H 2 O 2中检测。曲线 a 和曲线 b 之间电流信号的显着差异再次表明所提出的方法已经成功建立。因此，所有上述结果证明了电化学传感和化学分子识别相结合用于检测 5fU 的可行性。

图4.电极性能验证

检测条件的优化

为了提高这种电化学检测的效率，优化了检测中的几个重要影响因素，包括 SA-HRP 的浓度和孵育时间。结果如图 5A、B 所示，当前响应由 DPV 记录。图5A表明电流信号随着SA-HRP浓度的增加而逐渐增加，但在SA-HRP浓度为1 U/mL时几乎达到平稳状态；因此，选择 1 U/mL 作为 SA-HRP 的最终浓度。图 5B显示了SA-HRP的孵育时间的优化，其浓度为1 U/mL；与浓度优化类似，电流信号原本随着时间的延长而增加，30 min后几乎没有变化，因此，后续实验采用30 min作为SA-HRP的最终孵育时间。

图5. 检测条件优化

所提出的电化学方法用于在优化条件下检测不同浓度的 5fU。如图5C所示，对苯二酚氧化的电流信号随着5fU浓度的增加而逐渐增加。图 5D 表明电流变化值与 5fU 浓度从 0.1 到 10 nM 的对数值之间具有良好的线性关系，线性回归方程为 Δ I (μA) = 4.1231 Log c (μM) + 17.206 ( R 2 = 0.9931) , 检出限为 0.075 nM ( S / N= 3)。同时，作者将本文的方法与其他方法在选择性、线性范围和 LOD 方面进行了比较，例如 LC-MS 和荧光标记。总的来说，本文的方法在某些方面与荧光相当甚至优于荧光，但不如LC-MS，这是本文未来需要改进的地方。也许该方法中的多步反应是影响方法效率的关键因素。尽管如此，作者相信结合电化学传感的高灵敏度和基于小分子的化学识别的高选择性仍然是检测嘧啶修饰的有前景的策略

图6.电极稳定性、选择性和稳定性分析

选择性、重现性和稳定性

选择性是开发新方法的重要因素；因此，使用 T、5fC 和 AP 位点的其他一些 5fU 类似物来评估已建立方法的选择性。如图6A四条曲线分别代表固定有标记的ODN-5fU（曲线a）、ODN-AP（曲线b）、ODN-5fC（曲线c）和ODN-T（曲线d）的不同修饰电极的电流信号。所有核酸都经过了相同的化学处理和检测条件，但与其他核酸修饰的电极相比，只有标记的 ODN-5fU 修饰电极产生了显着的电流信号，表明所提出的方法由于其特异性识别而具有优异的选择性。随后，通过使用六个独立的电极，在相同处理下，在500Gy下检测5 nM γ-辐照的DNA，分析重现性，相关结果如图6B所示， 这六个电极的电流信号差异在可接近的误差RSD为6.67%，表明本文的方法具有较好的重现性。至于稳定性，PAGE分析证明azi-BIAN标记的靶标在储存过程中非常稳定；事实上，包括用azi-BIAN标记的ODN-5fU和进一步用DBCO-PEG4-Biotin标记的ODN-5fU在内的标记靶标的相对位置在储存5个月后几乎没有变化。

图7.实际样本检测

在混合样品、γ-辐照 DNA 和基因组 DNA 中的应用

为了评估该方法的应用价值，它被用来测定混合样品、γ-照射的 DNA 和从 HepG-2 细胞和 MCF-7 细胞中提取的基因组 DNA 中的 5fU 含量。对于混合样品，5fU 检测回收率约为 90-110%，RSD 分别为 3.47%、4.83% 和 6.94%。对于 γ 辐照的 DNA，将本文的结果与 LC-MS 的结果进行了比较，发现本文的方法得到的结果与LC-MS 得到的结果接近。对于基因组DNA，由于gDNA中5fU的丰度极低，无法直接量化，作者在提取的gDNA中加入不同数量的含有5fU的模块链来模拟真实样本，相关结果如图7所示. 可以发现，gDNA与ODN-5fU混合液的电化学信号高于gDNA空白，相对信号强度随ODN-5fU用量的增加呈上升趋势。所有上述结果表明我们的方法在检测核酸中 5fU 的应用中具有广阔的潜力。

利用 azi-BIAN 对 5fU 醛基的特异性化学识别，通过电化学技术开发了一种检测核酸中 5fU 的新方法。由于 azi-BIAN 对 5fU 具有优异的选择性，该方法可以成功地应用于 5fC 和 AP 位点干扰下的 5fU 检测。同时，在核酸5'端使用T4 PNK催化标记，绕过了序列限制，避免了捕获探针的必要性，进一步扩大了其在碱基修饰检测中的应用。最后，与荧光标记方法相比，该方法显示出从 0.1 到 10 nM 的良好线性范围和相对较低的 0.075 nM 检测限。而且，本文的方法对 γ 辐照 DNA 中 5fU 的检测结果与 LC-MS 的结果一致，表明电化学技术结合化学分子的选择性识别检测 5fU 具有广阔的前景。但遗憾的是，该方法的灵敏度仍不如LC-MS，完全标记的靶标不能保存一个月等长时间，这也是后续急需重点解决的问题。