DNA甲基化被用在哺乳动物早期胚胎发育过程中动态重编程细胞。DNA中的5 -羟甲基胞嘧啶( 5-hmC-DNA )在去甲基过程中起重要作用。DNA中的5 -甲基胞嘧啶( 5-mC-DNA )被胚胎干细胞和神经元中相对丰度较高的10 - 11易位蛋白氧化为5-hmC-DNA。本文研究了一种基于选择性电致化学发光( ECL )标记，KRuO₄将5-hmC特异性氧化为5-fC，定量5-hmC-DNA的新方法。将含5-hmC目标DNA的巯基捕获探针( ssDNA , 35-mer )自组装在金表面。目标DNA中的5-hmC经KRuO₄氧化选择性转化为5-fC，然后用N- ( 4 -氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺( ABEI )标记。将ABEI标记的靶DNA与电极上的捕获探针杂交，产生很强的ECL发光。5-hmC-DNA的检出限极低，为1.4×10^-13 M。此外，该ECL方法对血清样品中5-hmC的定量也是有用的。本工作表明，选择性5-hmC氧化结合固有敏感的ECL方法是一种很有前景的5-hmC生物传感策略。

DNA中胞嘧啶(C)的甲基化和去甲基化是大多数动植物基因组中存在的一种基本的表观遗传修饰。该过程在调控发育基因组稳定性、x染色体失活、染色质重塑、基因组印迹和基因表达等方面具有重要作用。异常的DNA甲基化是许多疾病的标志物，如癌症、神经系统疾病、糖尿病和心脏病。2009年新发现的5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)是一种自然产生的碱基，在神经元和胚胎干细胞中含量丰富。DNA中的甲基胞嘧啶(5-mC-DNA)被10−11易位(TET)蛋白氧化为5-hmC-DNA。最近，在DNA去甲基化的研究中，5-hmC作为去甲基化的重要中间体，非常重要。为了揭示5-hmC的产生与去甲基化机制之间的关系，需要一种有效地确定5-hmC的存在和丰度。

利用亚硫酸氢盐测序( BS-Seq )技术对5-mC进行了单核苷酸测序，但该技术无法区分5-mC和5-hmC。例如，已经开发了商业化的5-hmC抗体选择性富集5-hmC。尽管这些方法可以证实5-hmC的存在，但是在DNA样品中，检测特定序列中的5-mC是否羟基化，仍然是困难的。

因此，需要一种有效的化学方法来检测5-hmC。此外，发展一种能给出5-hmC阳性、5-mC阴性、5-C阴性结果的反应是可行的。5-hmC与5-mC和5-C的一些判别方法涉及BS-Seq和单碱基分辨率。5-hmC被KRuO₄完全氧化成5 -甲酰基胞嘧啶( 5-fC )产率高，5-fC可以转化为U，然后进行BS处理。因此，将oxBS-Seq和BS-Seq结果进行比较，定位基因组DNA内的5-hmC。利用β-糖基转移酶创新性地将5-hmC转化为β-葡萄糖基-5-hmC，经TET双加氧酶( Tet1 )氧化和BS处理后转化为尿苷( U )而屏蔽。与5-hmC相比，活性更强的5-fC可以与带有生物素或荧光基团的肼或羟胺衍生物反应，用于后续的测定。Zhou课题组发现了一种利用活性氨基染料或羟胺直接标记5-fC的方法。这些荧光染料在室温下无需催化剂就可以高选择性地标记5-fC，形成稳定的亚胺。通过该标记反应，5-fC-DNA可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE )或荧光测定进行鉴定。最近，Zhou课题组报道了一种基因组DNA内5-hmC的定量方法，该方法采用基于阳离子共轭聚合物的荧光共振能量转移( CCP- FRET )方法，结合5-hmC对5-fC的特异性氧化，其中CCPs作为能量供体。

电致化学发光( ECL )是指通过电化学反应在电极上产生高活性物质，从而在能量电子传递反应中出现激发态，产生光辐射。在过去的几十年中，ECL方法具有灵敏度高、背景低、重现性好等特点。在本研究中，作者建立了一种选择性氧化后ECL检测DNA中5-hmC的方法。本文首次报道了一种基于N- ( 4 -氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺( ABEI )的检测5-hmC的方法，该方法基于ABEI与5-hmC的偶联，KRuO₄高效选择性氧化为5-fC。底层机制如方案1所示。标记反应是一个两步过程：( 1 ) 5 - hmC被KRuO₄高效地氧化成5-fC，( 2 )醛基通过与ECL物质ABEI的氨基取代基共轭连接，形成ECL标记的5-fC-DNA ( 5 -fC-DNA-ABEI )。在外加偏压下，此DNA产物发出与5-hmC数成正比的ECL信号。因此，只有当DNA被5-fC修饰时，才能从ABEI标记的DNA中检测到明显的ECL信号。对比看出，当ABEI标记的DNA不被5-fC修饰时，未观察到ECL。本工作详细讨论了所提出的ECL方法，并给出了该技术对DNA中5-hmC的测定和对DNA中5-hmC和5-mC的区分性能。

方案1.基于ECL的用于检测5-hmC-DNA的检测方法示意图

5-fC-DNA的ECL标记

KRuO₄易溶于水，可以很容易地将5-hmC-DNA氧化成5-fC-DNA，产率较高。图1显示了不同修饰的ECL标记DNA的PAGE分析结果，相对位置根据其分子量而定。泳道 1、2和3分别代表DNA S5 ( C-DNA )、DNA S4 ( 5-mC-DNA )和DNA S2 ( 5-hmC-DNA )的氧化标记反应。图1的右图是在254nm紫外光下拍摄的。泳道1和泳道2没有荧光带表明正常碱基和5-mC不能被氧化；因此，ABEI不能与DNA S4中的碱基发生反应。DNA S2荧光带出现在泳道3。因此，5-hmC可以被KRuO₄选择性氧化，然后被ABEI标记。PAGE和HPLC均表明氧化和标记反应具有很高的产率( > 90 % )。紫外-可见吸收光谱也用来表征5-fC-DNA与ABEI的相互作用。图2给出了5-fC-DNA、ABEI和5-fC-DNA-ABEI复合物的吸收光谱。5-fC-DNA在284 nm处有明显吸收峰，而ABEI在240 nm处有吸收峰。5-fC-DNA-ABEI复合物在284 nm和240 nm处出现峰值，分别对应于5-fC-DNA和ABEI的吸收光谱。这些结果表明5-fC-DNA被ABEI标记，这些结果与PAGE分析结果能较好吻合。

图1. PAGE分析

图2.紫外可见吸收光谱分析

DNA固定在金表面

用X射线光电子能谱( XPS )对捕获的DNA S1在金表面的自组装进行了表征。图3A中的曲线a显示没有N ( 1s )信号峰，暗示裸金表面缺乏寡核苷酸。对于自组装DNA S1的金板和自组装DNA S1与DNA S2的杂交，图3A中的曲线b和c分别出现N ( 1s )峰。杂交过程导致N ( 1s )峰面积增加66.67 %，表明了自组装和杂交的成功。在XPS中，Au-S键( 162eV )和无连接的S ( 165eV ,图 3B )两个主要成分表明DNA S1通过Au-S键、S ( 2p ) ( 162eV )自组装到金表面。

利用原子力显微镜（AFM）对捕获的DNA S1金表面自组装的形貌进行了表征，并与DNA S2在金表面杂交。图4A显示了裸金表面的AFM图像( 703nm×703nm )。DNA S1金表面自组装(图4B )和与DNA S2杂交后的DNA S1金表面自组装均观察到织构化形态。图4C显示了相似的织构形貌，但与DNA S2杂交后，在DNA S1自组装金表面观察到了一个平均尺寸为124 nm的更球状形貌。图4D表示与图4B和4C相关联的典型线性扫描。固定化DNA S1的平均表观尺寸为80nm，表明其失去了线性形状，皱缩成小球状聚集体。DNAS1与DNAS2杂交后，平均表观尺寸增加到∼124nm。球状结构的横向平均尺寸的增加主要是因为DNAS1与DNAS2的杂交所致。

图3. XPS 光谱分析

利用原子力显微镜（AFM）对捕获的DNA S1金表面自组装的形貌进行了表征，并与DNA S2在金表面杂交。图4A显示了裸金表面的AFM图像( 703nm×703nm )。DNA S1金表面自组装(图4B )和与DNA S2杂交后的DNA S1金表面自组装均观察到织构化形态。图4C显示了相似的织构形貌，但与DNA S2杂交后，在DNA S1自组装金表面观察到了一个平均尺寸为124 nm的更球状形貌。图4D表示与图4B和4C相关联的典型线性扫描。固定化DNA S1的平均表观尺寸为80nm，表明其失去了线性形状，皱缩成小球状聚集体。DNAS1与DNAS2杂交后，平均表观尺寸增加到∼124nm。球状结构的横向平均尺寸的增加主要是因为DNAS1与DNAS2的杂交所致。

图4. 接触模式AFM图像

可行性研究

图5显示了DNAS1与不同DNA(DNAS2、DNAS3、DNAS4、DNAS5、DNAS6和DNAS7)杂交， 标记ABEI的ECL图谱。ABEI的ECL机理与鲁米诺相似，其氧化产物可能为重氮苯喹酮。重氮苯二氮通过过氧化氢转化为过氧化氢或内过氧化物，分裂重氮苯二氮环产生氨基检二酸的激发态，并发光。与图5中曲线a相比，相同浓度下ECL强度，是曲线b的3倍，因为DNAS3(3个5-hmC位点)中5-hmC位点的数量高于DNAS2(一个5-hmC位点)。这一结果表明，ECL强度与DNA羟甲基化水平相关。在其他测试DNA序列，包括DNAS4，DNAS5和未氧化DNAS2，出现轻微ECL强度变化，几乎相当于空白测量，因为5-mC位点DNAS4和5-C位点DNAS5不能选择性地转化为5-fC通过氧化KRuO₄，随后没有被ABEI标记。未氧化DNAS2中的5-hmC未被ABEI标记。此外，作者还选择了三个错匹配的序列(DNAS6)和一个非互补的序列(DNAS7)来评价该方法的选择性。与图5中的曲线h相比，ECL强度(图5中的曲线d和曲线f)几乎保持不变，因为DNAS6和DNAS7不能分别与固定在金电极上的捕获探针DNAS1有效杂交。这些结果表明，该方法对3个碱基错配的5-hmC-DNA具有良好的选择性，可用于5-hmC-DNA的分析。

图5. 不同DNA与ABEI结合的ECL强度与电位谱

检测条件的优化

图6A显示了自组装时间对ECL信号强度的影响。在120~240min的范围内，ECL强度随自组装时间的增加而突然增加。在270min时，ECL强度达到最大值，之后空间效应和静电效应逐渐占主导地位，ECL强度略有降低，同时呈现出更紧密的HS-DNA单层。因此，作者选择240min作为报告实验的自组装时间，以获得高灵敏度，同时缩短生物传感电极的制造时间。图6B显示了DNAS1和DNAS2之间的杂交时间对ECL信号强度的影响。在20~120min的范围内，ECL强度随着杂交时间的增加而突然增加，然后稳定在一个稳定值。因此，杂交发生在120min范围内。DNAS1−DNAS2的杂交动力学速度较慢，部分原因可能是实验中使用的DNAS2浓度较低(1.0×10⁻¹¹M)。为保证在较低的DNAS2浓度下进行完全杂交，将杂交时间设为140min。

图6.自组装时间和杂交时间对ECL的影响

线性范围和检测极限

为了评估所开发的生物图7显示了优化条件下的ECL响应作为DNAS2浓度的函数(图7A)和DNAS2的校准曲线(图7B)。图7A清楚地显示，当DNAS2浓度从5.0×10⁻¹³增加到5.0×10⁻¹⁰M时，ECL信号逐渐增加。此外，ECL信号强度与DNAS2浓度从5.0×10⁻¹³到1.0×10⁻¹⁰M成正比(图7B)。线性回归方程为I_ECL=77.264 C+865.076 ，回归系数为0.9954。检测限计算为1.4×10⁻¹³M（信噪比(S/N）为3）。由于ABEI具有优异的ECL性能，该方法的灵敏度远高于以前报道的方法。本文所提出的ECL生物传感方法的检测限远低于电化学方法(1.43×10⁻¹²M和1.6×10⁻¹⁰M)、CE-MS/MS分析(1.0×10⁻¹⁰M)40和荧光方法(1.0×10⁻⁸M)的检测限。此外，作者的方法的检测限是光学传感器报告 (4.2×10⁻¹³M)的3倍，远低于人类尿液样本的正常水平(22.6±13.7nM)。同一批次不同电极在1.0×10⁻¹¹M DNAS2下，10次重复测定的相对标准偏差(RSD)为4.32%，这表示良好的再现性。

图7.不同浓度的5-hmC-DNA的ECL响应

血清样品中5-hmC-DNA的检测

以陕西师范大学医院的人血清样本为例，通过临床测定5-hmC-DNA，验证了该基于ABEI的ECL方法的有效性。在100倍稀释的血清样品中加入最终浓度为10、40和80pM，制备添加5-hmC-DNA的血清样品溶液。表1所示的是从校准曲线(图7B)中获得了这些添加的血清样本中5-hmC-DNA的回收率。平均回收率为94.6%，RSDs分别为3.78%、4.61%和3.97%。这些结果表明，所开发的方法具有用于血清样本的潜力。然而，本研究中的ECL生物传感方法仅用于检测特异性靶标5-hmC-ssDNA，并已通过DNA序列分析进行了鉴定。在一定的反应条件下，双链DNA和长链DNA可以通过将双链DNA变性为ssDNA或设计与已知的长链DNA序列互补来检测。

表1.血清样品中5-hmC-DNA的回收率测定

基于电致化学发光(ECL)法，结合5-hmC特异性氧化为5-fC，开发了一种新的5-hmC的定量方法。该方法具有较高的特异性，因为针对5-hmC修饰的化学反应不能发生在与非羟甲基化的DNA碱基上。作为概念验证研究，本研究还表明，该方法对5-hmC-DNA的检测灵敏度高，检测限极低，为1.4×10⁻¹³M。对血清样本中5-hmC-DNA的检测表明，所提出的ECL策略具有较高的灵敏度和选择性。在未来的研究中，本文所提出的方法与商业ECL试剂盒的耦合将在其他DNA突变的即时检测中进行评估。