介绍一篇斯坦福大学Alice Y Ting课题组发表在Nat Biotechnol上的文章，该文章介绍了他们在BioID的基础上筛选出了两个比BioID邻近标记效率更高的biotin连接酶，并用质谱分析的方法对比了它们在体内外水平的邻近标记效率以及优缺点。这里提到的Alice Y Ting课题组主要从事生物体邻近标记的相关研究，他们利用各种邻近标记的方法来研究生物体的各种分子调控机制。酶催化的邻近标记技术是研究大分子复合物、细胞器以及蛋白互作网络的一种蛋白质组分析方法。通过与不同定位蛋白的融合将邻近标记酶定位到不同的细胞位置，可以实现对不同定位的细胞蛋白进行分析。小分子底物的加入就会开始催化邻近标记酶对目标位置纳米范围内的蛋白进行共价标记。然后可以对标记蛋白进行富集并通过质谱的方法鉴定这些蛋白。APEX2和BioID是目前被广泛应用的两种邻近标记酶。APEX2可以在1min或更短的时间内实现对邻近蛋白的标记，但是APEX2标记需要双氧水的加入，双氧水会对活细胞具有一定的细胞毒性。BioID是一种简单且没有细胞毒性的一种biotin连接酶，只需在标记之前加入biotin，然而BioID缓慢的动力学效应使标记长达18-24h或更长的时间。随后有关其他biotin连接酶的报道，例如BioID2和BASU，然而标记时间仍然需要至少16h。为了找到一种简单、无毒且高效的邻近标记酶，该研究对大肠杆菌biotin连接酶BirA进行了突变筛选，并对筛选得到的两种邻近标记酶TurboID和miniTurbo进行了体内外的标记效率表征。该研究首先通过错配PCR对BirA-R118S进行诱变处理，得到了一个大约107数量级的突变文库。这些BirA-R118S突变基因与酵母表面蛋白Aga2p融合表达，biotin和ATP加入后，通过streptavidin-fluorophore染色，即可在酵母膜表面展示biotin邻近标记位点，以此来比较不同突变位点对邻近标记效率的影响。
通过上述筛选，该研究发现了两种高效的邻近标记连接酶：TurboID和miniTurbo。通过比较TurboID、miniTurbo和BioID在不同细胞器位置的标记效率，研究发现TurboID仅需10 min就可以发现明显的标记信号，甚至在线粒体与内质网中其标记效率比BioID 18h的标记效率还要高。接着该研究用TMT标记的方式进一步在全蛋白质水平比较了TurboID、miniTurbo和BioID在不同细胞器位置的标记差异。对质谱结果进行分析发现，TurboID和miniTurbo在10min的邻近标记效率和特异性与BioID 18h的结果相近。除此之外，该研究也通过模式生物果蝇进一步在体内水平说明了TurboID和miniTurbo的标记效率以及特异性。TurboID和miniTurbo作为一种更有效的邻近标记方法，可以应用到更多蛋白相互作用的研究中。除此之外，该文章的在蛋白质组TMT标记的实验设计以及分析方法上也值得我们进一步学习。原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30125270/
目前评论：