给大家推送一篇2022年6月份发表在Cell Reports的文章。文章通讯作者是来自匹兹堡大学的Alexander Sorkin教授和哈佛大学的Steven P. Gygi教授。Alexander Sorkin教授课题组主要致力于癌细胞中表皮生长因子的研究，Gygi实验室的研究主要集中在基于质谱的蛋白质组学领域的开发和应用新技术中。

• 时间分辨邻近标记定义 EGFR 相互作用网络

研究人员制备了稳定表达EGFR-APEX2融合蛋白的细胞，分析了EGFR-APEX2被EGF激活后1小时内的邻近蛋白组（图1A）。蛋白质印迹分析，EGFR-APEX2 在 HCT116 细胞中的表达水平比内源性 EGFR 高 1.1 倍，而EGFR-APEX2 在 HEK293T 细胞中的表达水平是内源性 EGFR 的一半（图1B)。EGF 引起 EGFR-APEX2 中 Tyr1068 的强烈磷酸化，表明融合蛋白具有完全激酶活性，与未标记的 EGFR 相比，EGFR-APEX2 的这种磷酸化略有升高（图1A和1C）。EGF 还在 HCT116 和 HEK293T 细胞中触发Akt和ERK1/2信号通路的强烈激活（图 1A）。EGFR-APEX2 在 HEK293T 细胞中的表达不影响下游信号（图1A）。上述实验验证了使用表达高水平和低水平 EGFR 的两种细胞系作为研究 EGFR 时间分辨邻近蛋白质组的互补实验模型。

图1E说明了邻近近标记的实验流程，其中血清饥饿的 HCT116/EGFR-APEX2 或 HEK293T/EGFR-APEX2 细胞与生物素预孵育1小时，并用 100 ng/mL EGF 刺激。在细胞与 EGF 孵育的最后 1 分钟内，H2O2 催化位于 APEX2（半径约 20 nm）附近的细胞质暴露蛋白区域的生物素化。富集的蛋白被 LysC/胰蛋白酶消化，并使用串联质量标签 (TMT) 9-11plex 试剂进行标记，样品被质谱法分析（图 1E）。

在三个独立实验中对 1,886 种蛋白质进行了量化。这些蛋白质的热图显示EGF 处理后蛋白质与 EGFR-APEX2 具有明显的时间依赖性接近度（图2A）。量化的蛋白质根据倍数变化分为三组（图 2B）。第 1 组中的蛋白质在质膜相关类别中富集，第 3 组中的蛋白质在内涵体类别中富集（图 2C 和 2D）。邻近蛋白质组的动力学与配体结合的 EGFR-APEX2 从质膜到早期和晚期内体的重新分布一致。不同细胞区室中的蛋白质示例如图 2E 所示。

质膜蛋白脂蛋白受体 (LSR)、ERBB2、EGFR 和 EGFR 的异二聚体，以及小 GTP 酶 HRAS，EGFR 的下游信号效应子，在EGF 刺激10分钟后减少了2倍（图2E)。相比之下，早期内体相关抗原 1 (EEA1) 和HGS，在 10 分钟的时间点具有最大丰度（图 2E）。另一方面，已知存在于晚期核内体和溶酶体中的蛋白质，如 LAMP1、LAMTOR1 和 VTI1B，在 EGF 刺激 30-60 分钟后被发现在 EGFR-APEX2 附近富集（图 2E）。图2中的数据表明EGFR-APEX2的时间分辨邻近蛋白质组的动力学概括了配体诱导的内吞作用和受体通过内溶酶体的内吞后运输的典型动力学。

为了进一步剖析早期内吞作用中的蛋白质网络，用 HCT116 和HEK293T 细胞用 100 ng/mL EGF 刺激或不刺激 5 分钟（图 3A）。在 HCT116（图 3B）和 HEK293T（图 3C）细胞中，EGF 模拟后增加超过 2 倍且p 值 < 0.05 的蛋白质以红色突出显示。对两种细胞系中重叠的 1,206 种蛋白质进行了量化（图 3A–3C）。基因本体论分析表明，在 EGF 刺激的细胞中富含 EGFR 近端蛋白的三个主要功能组：(1) 参与网格蛋白介导的内吞作用的蛋白质，(2) 作为一般内体分选机制一部分的蛋白质，以及 (3) 蛋白质参与信号转导过程（图 3 ）。网格蛋白相关机制的存在表明网格蛋白介导的内吞作用有很大贡献在内吞作用期间和内体中与 EGFR 的相互作用（图 3B 和 3C）。

• TFG富集在EGFR-APEX2的邻近蛋白质组中

在EGFR-APEX2邻近蛋白质组中发现了TFG蛋白，在EGF刺激10分钟时达到最大丰度(图2E)。在HCT116细胞中，TFG的时间依赖富集谱与HGS(图2E)和其他内体分选蛋白，如STAM、STAM2和PTPN23的富集谱几乎相同。在用EGF刺激5分钟的HCT116和HEK293T细胞中都观察到TFG的强效变化(图3B和3C)。此外，在TMTplex11实验(图4A)中，EGF刺激后第一个10分钟内的相对蛋白质丰度的时间进程在两种细胞系中显示出相似的分布以及TFG随时间而变的丰富(图4B和4C)。总而言之，图2、图3和图4所示的邻近标记实验表明，TFG可能是对含有EGFR的内体进行分类的一个额外组件。先前的研究表明，TFG是一种位于ERES和ERGIC之间的聚合物支架，并提出TFG参与了COPII囊泡的剥离和它们向ERGIC靶膜的输送。

 Figure 4. Time-dependent enrichment of TFG in the proximity of EGF-activated EGFR-APEX2 and co-localization of TFG with internalized EGF-Rh