跟大家分享一篇发表在Nature Communications上的文章，文章的题目是“Spatiotemporal profiling of cytosolic signaling complexes in living cells by selective proximity proteomics”，本文的通讯作者是来自南方科技大学化学系的田瑞军教授，他们课题组的研究方向主要是基于生物质谱的蛋白质组学新方法和新技术以及基于化学蛋白质组学技术的动态蛋白质复合物研究。本文开发了两种邻近标记探针，能够实现活细胞溶质内信号复合体的时空特异性标记。
在酪氨酸磷酸化（pTyr）介导的信号网络中，酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶在微小的时间尺度上精确地调节pTyr位点，而通过特异性地识别pTyr位点能够实现动态信号复合物的组装。亲和纯化质谱（AP-MS）和定量化学蛋白质组学技术的开发促进了动态pTyr信号复合物的研究，但是在细胞裂解液中进行亲和富集会导致一些空间特异性和相互作用的损失，从而限制了其在具有时空特异性信号复合体研究中的应用。生物素化的邻近标记技术近年来被用于研究信号复合物，可以实现活细胞内10纳米左右空间范围的蛋白质标记，其中包括BioID、TurboID和 APEX技术。相比于BioID和TurboID技术，APEX可以通过H2O2激活生物素-苯酚自由基，苯酚自由基与邻近蛋白酪氨酸残基共价结合，能够在1min内快速完成蛋白质的标记。但是由于引入了高活性的自由基，导致标记背景很强，因此对于研究时空特异性动态蛋白复合物和胞质信号蛋白仍然具有很大挑战。本文作者受启发于APEX-RNA标记的方法优化，通过引入化学取代基来调节苯环的-OH键和-NH2键的键解离能（BDE），设计合成了12个生物素-苯酚衍生物以期缩小标记半径，试图增加标记特异性。之后，作者在活细胞内对化合物形成自由基的能力进行了检测，并通过western验证标记强度，发现BP5和BN2相比于BP1能够实现更大的转化率，而标记信号强度有所降低，因此作者认为二者能够实现更加选择性的标记。选择性的来源是这种高反应性中间体的淬灭，在BP5和BN2扩散并以非特异性方式标记相邻蛋白之前，会形成大量BP5-二聚体、三聚体和BN2聚合物，淬灭标记活性。
接下来，作者选择了具有时空特异性相互作用的胞质adapter蛋白为研究对象，研究了GRB2蛋白在酪氨酸激酶受体EGFR介导的通路中的相互作用蛋白。表皮生长因子EGF刺激后，经过BP5邻近标记和label-free定量蛋白质组学分析，证明BP5能够选择性识别GRB2相互作用蛋白，并且比BP1具有更高的选择性，识别到更多信号转导相关蛋白。此外，作者还在GRB2相互作用蛋白STS1和SHC1上进一步验证了BP5的选择性，并对BP5和BN2进行了比较。发现BN2适合在较小半径内标记胞浆内的直接相互作用蛋白复合物，而BP5可以在较大半径内有效地标记膜相关蛋白和胞质蛋白复合物。之后，作者研究了BP5时间特异性捕获STS1相互作用蛋白的能力，并与AP-MS结果进行了比较，发现邻近标记技术识别的EGFR核心信号蛋白复合体与AP-MS结果高度一致，而识别的其他亚细胞成分中的蛋白复合物比AP-MS更为全面。
总之，本文基于APEX技术开发了两个适用于邻近标记的生物素-苯酚探针，能够在活细胞中时空特异性的选择性标记相互作用蛋白。
本文作者：Cheny
责任编辑：LYP
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-20367-x
原文引用：DOI：10.1038/s41467-020-20367-x
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