给大家介绍一篇来自“Cell Reports”上的文章，题名为“Time-resolved proximity labeling of protein networks associated with ligand-activated EGFR “在这篇文章中，该课题组结合了过氧化物酶催化的邻近标记、等压肽标记和定量质谱来定义配体激活的 EGFR的邻近蛋白质组的动力学。他们确定了一个信号蛋白网络，该网络在受体内化和通过内体系统运输期间仍与受体相关。他们展示了 Trk 融合基因 (TFG)，并证明 TFG 调节 EGFR 的内体分选。

通过时间分辨 APEX 介导的标记跟踪活化 EGFR 的邻近蛋白质组

为了分析配体激活的 EGFR 邻近蛋白质组的时间依赖性变化，他们生成了稳定表达C 末端与 APEX2融合的 EGFR 的人结肠癌 HCT116 和人胚胎肾HEK293T 细胞系。

图1

图 1 E 说明了接近标记实验的流程。为了跟踪 EGFR-APEX2 的时间依赖性邻近蛋白质组，缺少血清的 HCT116 细胞不处理/与 EGF 一起孵育 1、10、30 和 60 分钟，并如图 1 E所示进行邻近标记。量化的蛋白质的热图显示，在 EGF 处理后，蛋白质与 EGFR-APEX2 具有明显的时间依赖性接近。图2中的数据表明，EGFR-APEX2的时间分辨邻近蛋白质组的动力学概括了配体诱导的内吞作用和受体通过内溶酶体隔室的内吞后转运的典型动力学。为了进一步剖析早期内吞作用中的蛋白质网络，他们对 HCT116 和 HEK293T 细胞进行了接近标记实验，之后对与 HGS 和其他分选内体蛋白共富集的蛋白质的时间依赖性丰度分布进行分析，PIK3R2和 PIK3RCA/B内体中保持接近 EGFR 的信号蛋白网络。

图2

多种信号蛋白在其内吞过程中仍靠近 EGFR

在用 EGF 刺激 5 分钟的 HCT116 和 HEK293T 细胞中都观察到了 TFG 的强烈富集。此外，在 TMTplex11 实验中，EGF 刺激后前 10 分钟内相对蛋白质丰度的时间过程证明了两种细胞系中三组的相似分布以及刺激和时间依赖性富集EGFR 附近的 TFG。总而言之，图 2、3和4中呈现的邻近标记实验表明，TFG 可能是分选含有 EGFR 的内体的额外组成部分。用 EGF-罗丹明 (EGF-Rh) 偶联物刺激 15 分钟并用 TFG 抗体染色HCT116/EGFR-APEX2 细胞的免疫荧光显微镜显示内源性 TFG 呈点状分布模式。实验表明，大部分 TFG 位于 ERES，但较小但大量的 TFG 要么与含有 EGFR 的内体区室相关，要么位于靠近内体膜。

图3

Trk 融合基因 (TFG) 与早期和分选内体有关

为了解决靶向早期/分选内体的 TFG 是否依赖于 EGF，未处理和用 EGF-Rh 处理的 HSC3 细胞与 TFG 和 EEA1（早期/分选内体）、HGS（分选内体）或 Rab5（早期内体）共染色 抗体。在未处理和刺激的细胞中，TFG 与 EEA1 阳性内体部分共定位。数据表明，仅仅在内体中存在 EGFR 不足以增加 TFG-EEA1 的共定位。总的来说， TFG 与早期/分选内体组成性相关，并且 EGFR 的配体激活增强了这种关联，可能是在内体成熟过程的一个阶段，在 p38/MAPK 激活后未配体 EGFR 积累的早期内体阶段之后。

图4

TFG 调节 EGFR 的内体分选

为了开始研究内体和 EGFR 内吞转运中的 TFG 功能，他们使用放射性标记的 EGF ( 125 I-EGF) 在 HSC3 细胞中检查了 TFG 的小干扰 RNA (siRNA) 敲低对 EGFR 内化、降解和再循环的影响。TFG 敲低调节 EGF:EGFR 复合物的内体分选并导致内体扩大。数据表明，TFG 消耗在配体结合的 EGFR 的内体分选中具有调节作用。

总之，该研究提供了 EGFR 的时间依赖性纳米级环境的综合资源，从而为发现受体酪氨酸激酶的信号传导和细胞内运输的新调节机制开辟了途径。在邻近标记实验中使用在内源性 EGFR 存在的情况下表达重组 EGFR-APEX2 的细胞是此研究的局限性，因为EGFR内吞转运过程的饱和动力学导致了在过表达该受体的细胞中，配体诱导的EGFR下调减慢。

作者：YXQ

责编：FJY

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110950