分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Automated Specific Amino Acid Footprinting Mass Spectrometry: Repurposing an HDX Platform for Determining Reagent Feasibility1。该文章的通讯作者是来自美国华盛顿大学的Michael L. Gross教授。
蛋白印迹法（protein footprinting）是测定蛋白构象变化的常用方法。通过使用化学试剂对蛋白表面或溶剂可及区进行标记，这些标记过程可以简单到用氘（D）替代氢（H），也可以复杂到需要添加大体积的光亲和标签。这些标签标记的位点、区域、残基特异性组成了一幅“印迹”图，以告知蛋白的空间结构。再通过测定不同状态下的蛋白标记水平的变化，实现对蛋白空间结构变化的监测。目前，最常用的基于质谱的共价标记方法包括：氢氘交换质谱（HDX-MS）、表面标记质谱（CL-MS）。HDX-MS与CL-MS最大的区别在于，HDX-MS的氘代标记过程是可逆的，为了尽可能减少回交、维持蛋白的标记状态，标记后的整个过程都需要在低温、酸性条件下进行。这种苛刻的实验条件极大地限制了HDX-MS的应用。相较而言，基于不可逆共价修饰的CL-MS分析则更加灵活、实用。CL-MS又分为特异性和非特异性的氨基酸标记。非特易性氨基酸标记由于生成的产物种类较多导致数据分析较为困难，特异性氨基酸标记则是目前主流的标记方法，但标记试剂的选择以及最佳反应条件的优化是非常耗时，本文开发了一种方法能够利用HDX自动进样系统（Trajan’s LEAP HDX automated workflow）快速筛选合适的标记试剂和最佳的标记反应条件。作者共选择了两个生物体系：肌红蛋白（Mb）-血红素（heme）以及钙调蛋白（CaM）-钙离子（Ga2+）。如图1所示，Mb主要通过His残基与heme发生相互作用（图1a），而CaM则主要通过Asp、Glu与Ga2+发生相互作用（图1b）。两个体系分别适合不同的标记试剂，作者用HDX自动进样系统考察了不同标记试剂在这两种生物体系中的标记情况，具体的流程如图2所示：CL-MS与HDX-MS流程大体一致，包括标记、淬灭两个步骤。对于一步反应的试剂如：DEPC，可以直接按照HDX-MS的流程进行，只是需要更换一下蛋白、标记试剂的添加顺序。而对于两步反应的试剂，如EDC+GEE，则需要增加一步用于添加标记试剂2。
图1. a)肌红蛋白（Mb）-血红素（heme）b)钙调蛋白（CaM）-钙离子（Ga2+）的晶体结构。
图2. HDX自动进样系统用于CL-MS分析的流程图。a）HDX 分析流程，b）一步标记反应流程，c）两步标记反应流程。
如图3，作者首先考察了DEPC标记试剂在Mb-heme和CaM-Ca2+这两种生物体系中的标记情况。随着DEPC的浓度增加，标记量在逐渐增加（图3b，f）。将不同状态下（holo/apo）蛋白标记水平（Fraction Modified/Weighted Number of Modification）随DEPC浓度变化整理作图（图3c,d,f,g）。从图3c,d可以观察到相比较apo-Mb，holo-Mb的DEPC标记量明显下降，说明heme的加入导致Mb的DEPC标记量下降，而heme本身是不会与DEPC反应的，标记量的下降只有可能是由于heme与Mb结合，导致结合位点的His无法与DEPC反应，最终蛋白整体的标记量下降。而对于CaM-Ca2+体系，holo-CaM与apo-CaM的标记量并明显区别，这是因为CaM与Ca2+主要是通过Asp、Glu氨基酸残基发生相互作用，而DEPC主要与含有-NH2, -OH, -SH基团的His, Cys, Tyr, Ser, Lys, Thr发生反应，所以Ca2+离子与CaM结合并不会影响CaM上DEPC的标记量。所以，对于CaM-Ca2+这样通过Asp、Glu发生相互作用的体系来说，能够与-COOH反应的EDC+GEE标记试剂更加适合（图4f-h）。正文中，作者还对EDC和GEE的浓度进行了优化，发现EDC是限速试剂（图4b-e）。同时，GEE+EDC的两步标记反应也容易产生较多的副产物，甚至还产生蛋白交联复合物，这也有助于获得更多的结构信息。
图3. DEPC标记试剂在Mb-heme和CaM-Ca2+两种生物体系中的标记情况。
图4. EDC+EGG标记试剂在CaM-Ca2+生物体系中的标记情况。
总之，本文巧妙地将HDX自动进样系统用于CL-MS分析，显示出较好的精密度和重现性。为CL-MS自动化分析提供新思路。
原文：Automated Specific Amino Acid Footprinting Mass Spectrometry: Repurposing an HDX Platform for Determining Reagent Feasibility
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