分享一篇发表在ACS Chmical Biology上的文章：Pepstatin-Based Probes for Photoaffinity Labeling of Aspartic Proteases and Application to Target Identification，通讯作者是鲁汶大学细胞与分子医学系的Steven Verhelst副教授，他的研究方向是化学蛋白质组学。
天冬氨酸蛋白酶在人体的生理病理过程中发挥着重要作用，如组织蛋白酶D（CTSD）与乳腺癌预后不良相关。ABPP鉴定天冬氨酸蛋白酶最常用的方法是在抑制剂上引入光反应基团获得亲和探针（AfBPs），如γ-分泌酶（Semin. Cell. Dev., Biol., 2020, 105, 43-53）的鉴定，但针对可溶性天冬氨酸蛋白酶的AfBPs非常有限。本文作者以天冬氨酸蛋白酶抑制剂pepstatin为基础，开发了CTSD的光亲和探针。
Pepstatin是从放线菌中分离的天然产物，由3个氨基酸、2个statine残基和N-异戊酰基帽子构成。作者猜想pepstain的各种残基可以容纳位阻小的光交联基团双吖吡啶，于是固相合成了四种探针Probes 4-7，在不同位置引入双吖吡啶，C端引入用于Click反应的azide-tag。
接着，作者测试了探针的反应性。一方面，在猪胃蛋白酶和牛凝乳酶中，AfBPs存在浓度依赖性响应，标记能力受限于双吖吡啶的位置和靶蛋白种类，检出限可低至10-50 ng胃蛋白酶和50-100 ng凝乳酶。另一方面，用AfBPs标记人癌细胞MCF-7, HT-29和 HeLa裂解液，结果显示MCF-7标记最强，当Probes 4&7浓度低至1-2 μM时，CTSD标记已达到饱和。此外，pepstatin A（CTSD inhibitor）的梯度竞争证明AfBPs与母体pepstatin结合位点相同。
随后，作者将Probe 4标记的MCF-7裂解液中的蛋白进行富集、酶解、LC-MS/MS检测，鉴定潜在的target。总共分为三组（1：DMSO；2：Probe 4 + pepstatin A competition；3：Probe 4），3与对照组1、2相比，只有CTSD同时都富集，加之CTSD具有最高的PSMs，推测CTSD是AfBP的主要靶标。除了CTSD，3相较于对照组还识别到其它10种蛋白，说明CTSD可能与其它蛋白间存在相互作用（PPIs），但由于PPIs很弱，所以在重复中检测不到。
于是，作者放宽filter条件，结合深度学习算法筛选出6个潜在蛋白，其中sequestosome-1(SQSTM)因和CTSD都在细胞自噬中起作用而被重点关注。为了探究SQSTM1是否是CTSD的底物，作者发现i）在CTSD存在下，SQSTM1随时间推移被消化，且这种消化被pepstatin A所抑制；ii）T-REx 293细胞饥饿24 h诱导SQSTM1水平降低后，加入papstatin A可缓解SQSTM1的减少。同时，考虑到CTSD是溶酶体水解酶，而溶酶体SQSTM1与自噬体融合后被溶酶体蛋白酶降解，作者推论SQSTM1可作为CTSD的底物。综上，本文开发了基于pepstatin的天冬氨酸蛋白酶光亲和探针，可高灵敏度地检测细胞裂解液中的CTSD。这种AfBP使用市售的building block，完全固相合成，方便在多肽文库引入其他氨基酸，快速优化天冬氨酸蛋白酶的选择性探针。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.2c00946文章引用：10.1016/j.semcdb.2020.03.002
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