细胞外囊泡（EVs）是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡结构统称，通常分为以下三种亚型：外泌体（30-100 nm）、微泡（100-1000 nm）和凋亡小体（1000-5000 nm）。EV可由所有类型的细胞产生，位于体液和血液循环中，因此这些纳米颗粒成为三种液体活检应用之一。核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)和蛋白质是封装在EV中的生物分子货物，它们反映了其组织或器官中的生物分子。EV及其货物的检测和表征可以为疾病诊断和治疗监测引入丰富的循环生物标志物来源。在过去的二十年里，已经开发出大量技术来检测和分析EVs。一些传统技术根据其物理特性（即尺寸或密度）分离血液中的EV，例如超速离心、过滤、沉淀、微流体富集等。然而，超速离心不方便且需要大型仪器，而且不同技术的EV分离性能报道差异很大。因此，迫切需要开发高效分离EV的技术。随着下游分子表征的实施，已开发新技术用于更有效和方便的EV富集方法。已经报道一种强大的肠道病毒富集技术，该技术结合了脂质标记和磁珠，可有效标记和回收血浆样品中的肠道病毒。这使得对非小细胞肺癌患者的表皮生长因子受体(EGFR)和柯尔斯顿鼠肉瘤病毒癌基因同系物(KRAS)基因突变的下游分析成为可能。双层膜是EVs最显著的特征，通过插入亲脂性膜染料(例如PKH26和PKH67)来标记EV膜是表征EVs的最常见方式。脂质标记的使用允许独立于表面抗原的EV捕获，并且可以捕获和富集所有EV。

该团队在EV捕获技术中利用脂质标记，开发了一种快速EV富集方案。该方案将基于脂质标记和点击化学介导的EV捕获结合到微珠（即点击珠）上，从而允许通过简单的离心分离EV。在这项研究中，带有DSPE-PEG1000-TCO的Click Beads能够有效捕获多种来源的癌细胞的EV，例如上皮细胞（例如胰腺癌）和间充质细胞（例如尤文肉瘤）。采用这种简化的过程来定量检测基因突变、基因重排，证明了基于Click Beads的总EV捕获方案与癌症特异性基因改变检测和量化相结合，可以进行无创癌症诊断和治疗监测。该研究以“Coupling Lipid Labeling and Click Chemistry EnablesIsolation of Extracellular Vesicles for Noninvasive Detectionof Oncogenic Gene Alterations”为题发表在《Advanced Science》杂志上。

图1.用于捕获和表征细胞外囊泡(EV)的简化工作流程示意图。i) 用反式环辛烯TCO标记EV（10 min）：血浆中的EV通过插入DSPE-PEG1000-TCO的脂质基序被TCO标记。ii) 通过点击化学捕获EV（15 min）：TCO标记的EV通过生物正交点击化学反应固定在四嗪(Tz)接枝的微珠（即点击珠）上。iii) 快速离心（2 min）：在Click Beads上捕获的EV通过300 g离心分离。iv) 通过逆转录数字PCR (RT-dPCR)分析EV衍生的mRNA：首先裂解EV，释放EV衍生的mRNA，然后通过RT-dPCR对其进行下游基因分析。该过程用于定量检测癌症患者的基因改变（即尤文肉瘤中的EWS/FLI-1重排和胰腺癌中的KRAS突变）。

图2. EV捕获前后Tz接枝微珠（即点击珠）的制备和表征。 A) Click Beads的逐步制备。 B) 二氧化硅微珠、NH₂改性微珠和Tz接枝微珠（点击珠）表面化学成分的元素分析。 C) 二氧化硅微珠（蓝色）、NH₂改性微珠（红色）和Tz接枝微珠（Click Beads，灰色）的Si2p、C1s、N1s 和O1s的高分辨率扫描。 D) TCO共轭Cy5标记前后Click Beads 的荧光显微照片。 E) 对于Click Beads和Cy5 标记的Click Beads观察到的平均荧光强度直方图。 F) 二氧化硅微珠、NH₂改性微珠和Click Beads的表面zeta电位。 G,H) 来自A673细胞的EV在通过抗CD63接枝金纳米粒子进行免疫染色前后的代表性透射电子显微镜(TEM)图像（比例尺，100 nm）。 I) 基于TEM成像的A673细胞衍生EV的尺寸分布（n=291,直径30–400 nm）。 J) 具有固定EV的Click Bead的代表性扫描电子显微镜(SEM)图像（比例尺，500 nm）。插图描述了TCO标记的EV如何固定在Click Bead上。 K) 高分辨率SEM，显示在Click Beads表面捕获的EV。 L) 在通过抗CD63接枝的金纳米粒子进行免疫染色后，在Click Bead上捕获的EV的代表性高分辨率TEM图像。

图3. A) 为优化基于Click Beads的EV捕获而开发的工作流程，使用人工血浆样本，其中含有A673细胞衍生的EV。对EWS / FLI-1 mRNA进行定量，以确定EV捕获产量。 B) EV捕获产量与DSPE-PEG₁₀₀₀-TCO的量(nmol)的函数关系。C) EV捕获产量与DSPE-PEG₁₀₀₀-TCO的孵育时间(min)的函数关系。D) EV捕获产量与Click Beads的量的函数关系。E) EV捕获产量与点击化学反应时间(min)的函数关系。F) EV捕获产量与离心时间 (min) 的函数关系。G) 使用10⁷个点击珠与100 μL血浆的固定比例(即，10⁷点击珠对应0.1 mL血浆，5×10⁷点击珠对应0.5 mL血浆，10⁸点击珠对应1.0 mL血浆)，不同体积(mL)的人造血浆样本的捕获产量和EWS/Fli-1mRNA拷贝的数据。H) 点击珠的动态范围显示了在1 mL人工血浆样品中掺入的A673细胞衍生的EVs的量(a.u.)和检测到的EWS/FLI-1 mRNA的拷贝之间的线性相关性。I) 使用以下五种EV分离方法对四种类型的EV掺入人工血浆样品(两种尤文肉瘤细胞系A673和ES-5838，以及两种胰腺癌细胞系CFPAC-1和AsPC-1)观察到的捕获产量进行比较：具有DSPE-PEG₁₀₀₀-TCO的点击珠、具有抗CD63-TCO的点击珠、ExoQuick、通过生物素修饰DSPE的磁珠和超速离心。

图4. A) 为量化尤文肉瘤患者血浆样本中的EWS基因重排而开发的工作流程（基于Click Bead的EV捕获+RT-dPCR量化）。 B) 比较来自12名尤文肉瘤患者的配对组织和血浆样本的两种EWS重排亚型（即EWS/FLI-1和EWS/ERG）。 C) 在尤文肉瘤患者(N = 35)和健康供体样本中(N=10)检测到的EWS/FLI-1 mRNA拷贝的箱形图。箱线图显示从最小值到最大值、中值和25-75%IQR。使用t检验评估不同组之间的显著性差异（P<0.001）。 D) EWS/FLI-1 mRNA拷贝（每1.0 mL血液）与测定时间的关系图，描述了尤文肉瘤患者(ES07)的缓慢疾病进展。正电子发射断层扫描——在治疗前和治疗后164天拍摄的计算机断层扫描(PET/CT)图像。 E) EWS/FLI-1 mRNA拷贝与时间的关系图，描绘了尤文肉瘤患者(ES08)的快速疾病进展。治疗前、治疗后19天和51天拍摄的CT图像。

图5. A) 为定量胰腺癌患者血浆样本中的KRAS突变而开发的工作流程（基于Click Bead的EV捕获+ RT-dPCR量化）。 B) 比较来自13名胰腺癌患者的配对组织和血浆样本的KRAS野生型和三种KRAS突变转录本亚型（即 G12D、G12V、G12R）。 C) 在胰腺癌患者(N=35)和健康供体样本中(N=10)检测到的总KRAS转录本拷贝的箱线图。箱线图显示从最小值到最大值、中值和25-75% IQR。使用t检验评估不同组之间的显著性差异（P=0.01）。D) 总KRAS突变转录本（每1.0 mL血液）和CA19-9水平(U mL-1)与测定时间的关系图描绘了胰腺癌患者(PanC03)的治疗反应。治疗前19天、84天和210天后拍摄的计算机断层扫描(CT)图像。

总之，结合脂质标记和点击化学可以有效分离EV，以对尤文肉瘤和胰腺癌中的致癌基因改变进行无创检测、表征和量化。该团队简化的工作流程结合了基于Click Bead的EV捕获和基于RT-dPCR的致癌基因改变量化，在检测疾病进展和监测治疗反应方面显示出潜在的临床应用。与他们之前通过EV Click Chips发布的EV纯化方法相比，Click Beads可以在大多数研究实验室中使用，无需专门的设备设置来处理更广泛的血浆样本量。Click Beads捕获的EV可以成为一种潜在的无创诊断工具，用于反馈早期治疗反应或抢救疗法的治疗效果。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202105853

裴仁军，中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所研究员。

学习/工作经历：

1989.09-1993.06 武汉大学化学系，本科生
1993.09-1998.06 武汉大学化学与分子科学学院，博士
1998.07-2000.11 中国科学院长春应用化学研究所，博士后
2000.11-2001.08 美国南伊利洛伊大学化学与生物化学系，博士后
2001.08-2003.10 日本京都大学化学研究所，博士后
2003.11-2005.02 美国哥伦比亚大学医学系，博士后
2005.03-2011.11 美国哥伦比亚大学医学系，副研究员
2011.11- 中科院苏州纳米所，研究员

研究领域和兴趣：

1）液体活检和纳米生物传感，如基于纳米结构和界面分子的协同效应的循环肿瘤细胞的高效捕获和分离；2）生物相容的靶向MRI造影剂及荧光探针；3）靶向纳米载体和纳米药物；4）纳米生物材料和3D生物打印材料；5）适配体筛选。

Hsian-Rong Tseng，加州大学洛杉矶分校大卫格芬医学院教授。

教育经历：

1993年 台湾东海大学，化学学士学位

1998年 台湾国立台湾大学，有机化学博士学位

2003年 加州大学洛杉矶分校洛杉矶分校，超分子和物理化学 博士后

研究领域和兴趣：

为癌症和遗传疾病开发基于纳米技术的诊断和治疗解决方案。

课题组主页：

https://uclaliquidbiopsy.org

朱亚珍，加州大学洛杉矶分校大卫格芬医学院助理教授。

学习/工作经历：

2005年在武汉大学获得医学博士学位；2010年在复旦大学获得病理学博士学位；2012-2017年在广东省中医院完成住院医师培训，担任病理学主治医师；2015年加入UCLA Pharmacology担任访问助理项目科学家；2020年成为克伦普分子成像研究所和分子与医学药理学系的教员。

研究领域和兴趣：

液体活检标志物的独特潜力，包括循环稀有细胞和细胞外囊泡 (EV)，以促进癌症和产前诊断平台的临床转化和验证。

编辑：肖飞

审核：贺芳

推送：朱聪