Sci. Adv.| 通过细菌荚膜多糖的靶向代谢标记对大肠杆菌K5和糖胺聚糖前体进行成像

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给大家介绍一篇Science Advances上的文章，标题是“Imaging of Escherichia coli K5 and glycosaminoglycan precursors via targeted metabolic labeling of capsular polysaccharides in bacteria”，通讯作者是山东大学国家糖工程中心的生举正教授。生举正教授的主要研究方向是化学糖生物学和糖胺聚糖类药物。将非天然化学基团引入糖胺聚糖(GAG)具有巨大的潜力，可以促进对这些关键的、广泛应用的分子进行机制和应用研究。本文利用非天然N-乙酰己糖胺类似物通过细菌代谢进入大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的荚膜多糖中。得到了靶向代谢标记透明质酸和肝素、硫酸软骨素的前体。通过叠氮标记的多糖与染料反应，通过生物正交化学实现了检测和成像；同时荧光团直接引入细胞表面后为观察和定量细菌在体内和体外提供了另一种选择。此外，叠氮多糖保留了与其天然类似物相似的生物学特性，并且在二糖重复单元中可靠和可预测地将功能(如荧光团)引入叠氮-N-己糖胺上，为在体内和体外对GAG进行成像和代谢分析提供了化学工具。


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糖胺聚糖（GAG）广泛分布于细胞外基质和哺乳动物细胞表面，除核心四糖以外，GAG主要由不分支的糖醛酸和己糖胺的二糖重复单元组成，常见的GAG包括透明质酸，肝素，硫酸肝素，硫酸软骨素等。GAG与多种细胞外信号分子发生相互作用，或被作为药物使用，代谢糖工程是研究聚糖结构功能的有力工具，但目前还没有通过代谢方法进行细菌GAG标记的工作。许多细菌荚膜具有重复的二糖单元，可作为GAG的前体。例如，A型多杀巴斯德菌，A型及C型链球菌产生透明质酸，E. coli K5和D型多杀巴斯德菌荚膜由肝素原（K5聚糖）构成，软骨素在F型多杀巴斯德菌，E. coli K4和禽杆菌属中被发现。因此，利用荚膜的合成通路进行代谢标记理论上是可行的。
肝素原由非硫酸化的-4GlcA-β(1,4)-GlcNAc-α(1-单位组成。为了验证E. coli K5能否被标记，作者破坏了肝素原的天然合成通路，引入诱导型表达的肝素原合成酶PmHS2，破坏UDP-GlcNAc的天然合成通路。在野生型大肠杆菌K5株中，K5荚膜的生物合成涉及酶KfiA和KfiC的协同作用，其中KfiA是UDP-GlcNAc：肝素原α-1,4-GlcNAc转移酶，但KfiA并不能容忍UDP-GlcNAz，而P. multocida 来源的PmHS2可以，因此作者使用CRISPR-Cas9将KfiA基因敲除，将PmSH2敲入。同时为了提高GlcNAz代谢效率，作者将E. coli的UDP-GlcNAc天然合成通路破坏，得到的glmSΔK5株可以通过回补GlcNAc，利用 nagE–nagA 通路存活。此外，Bifidobacterium longum 来源的NahK和人源的AGX1能催化磷酸化。最终，作者将得到的E. coli K5 KfiAΔ-glmSΔ-NahK-AGX1-PmHS2-K5命名为E. coli K5ASSH。（图1A, 1B）
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图1. 将GlcNAc类似物引入大肠杆菌K5荚膜多糖


在进行K5ASSH培养时为了提高标记效率，所有培养基中GlcNAc成分都用GlcNAz或GlcNAl替代。并都能通过FAM或罗丹明一步Click偶联得到强荧光信号。为了进一步证明标记发生在K5ASSH肝素原上，使用endo-β-裂解酶HepIII将α-1,4连接的GlcNAc及其类似物切下，结果荧光消失。进一步通过HPLC-MS鉴定到二糖产物峰，虽然非天然糖能通过体内一些代谢途径转化为天然糖，但由于培养基中全由非天然糖替代，天然糖的影响被降到很低。（图1C）

作者对E. coli K5成像进行了两个应用展示。第一，作者成功观察到菌株K5与小鼠巨噬细胞接触的吞噬过程(图2A, 2B)。作者利用结构光照明对这一过程进行定量化分析，并用流式分析巨噬细胞感染K5的比例（图2C），内化大肠杆菌K5在巨噬细胞中复制的能力也被确定。第二，带有叠氮K5荚膜聚糖的K5ASSH被用来监测菌体在肠道内的分布和定植，并实现了定植过程的可视化（图2D, 2E, 2F）。
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图2. GlcNAz处理的E. coli K5在巨噬细胞和小鼠中的Click标记和荧光成像。


作者用相同的办法使用枯草芽孢杆菌168株 生产透明质酸和软骨素， 利用类似原理的AC exolyase处理后得到二糖单位，通过Click荧光标记，流式，HPLC-MS确认合成成功。总的来说，叠氮-软骨素产量约26 mg/L，叠氮-透明质酸约75 mg/L，叠氮肝素约25 mg/L。

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图3. 叠氮GAG与大肠杆菌K5的凝集素结合微阵列


作者探究了叠氮-肝素原以及E. coli K5与lectin的结合能力，使用了一种包含70种lectin的微阵列，使用静电和动态竞争结合归一化的方法验证叠氮GAG与lecin的亲和力改变（图3A）。作者分类出了三种叠氮GAG，第一种是数值不变的，这说明天然或叠氮透明质酸均不被该类lectin识别，第二种是叠氮修饰增加了透明质酸和lectin的亲和力，第三种则是亲和力降低（图3B）。并分别对透明质酸，软骨素，肝素和E. coli K5也进行了分类（图3C）。此外，使用肝素或肝素-透明质酸混合物先后用lectin微阵列进行检测，作者发现在一些阵列孔中，肝素作为“helper”或“coreceptor”使透明质酸与lectin亲和力增加（图3D）。

为了探究叠氮-GAG作为一种化学生物学工具的潜力作者进行了一系列动物实验。在小鼠膝关节先后注入叠氮GAG和炔基-Cy5并发现了显著荧光，证明叠氮-GAG可用于生物医学工程的潜力（图4A）。为了验证叠氮-透明质酸能否作为天然透明质酸的模拟物，探究透明质酸的体内半衰期，在每天注射0.8 mg 叠氮-透明质酸的情况下，膝关节腔注射DBCO-Cy5两天后观察荧光并制作荧光衰减曲线（图4B, 4C）。作者发现，患有关节炎的膝关节代谢透明质酸的速度明显快于健康膝关节，这证实叠氮-透明质酸不仅是透明质酸研究的一种合格的成像工具，而且还显示出潜在的诊断和治疗潜力（图4D）。最后，用叠氮-透明质酸制备多糖水凝胶，并皮下注射到小鼠体内。多糖的分子量约为12 kDa。然后，评估该透明质酸-水凝胶的体内降解和置换情况。体内保留时间为90天，消除半衰期为21天。值得注意的是，基于作者的成像方法成功地观察到了水凝胶在体内的位移(图4E)。第3天，小鼠侧翼可见明显的透明质酸荧光。第68天翻转小鼠体位，观察到透明质酸移位90°。本文结果表明，叠氮-透明质酸将是研究含透明质酸的生物医学材料皮下置换的有效工具。

总的来说，作者通过一系列代谢工程操作和条件控制实现了细菌荚膜GAG的代谢标记，并制备了多种叠氮-GAG产物，进一步在菌群定植，胞内菌成像，体内GAG代谢体系中都进行了验证。


本文作者：MY

原文引用：10.1126/sciadv.ade4770

责任编辑：LD


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