本文是一篇发表在Chem. Eur. J.上的文章，通讯作者是北京大学化学与分子工程学院陈兴教授。其主要研究化学糖生物学和生物纳米技术研究，对活细胞及或活体中聚糖的化学标记；糖的合成，成像和组学分析；糖基化功能；糖代谢与糖基化的内在联系以及基于生物正交反应的化学生物学技术等。在本文中其介绍了一种全新的，可以在10 g量级上大量合成未保护的和1,6-二酰化的非天然糖的简易化学合成方法，同时整个过程无需硅胶色谱纯化，也避免了原先方法中存在的大过量叠氮钠导致的潜在爆炸风险。而后通过使用该方法合成的非天然糖对小鼠进行聚糖代谢标记（MGL）验证了该方法合成的非天然糖具有良好的代谢性能，同时证明了1,6-二酰化非天然糖是聚糖代谢标记最佳的化学报告分子。聚糖是重要的四大生物大分子之一，由于其并不由中心法则直接编码产生，同时聚糖的单体大多仅存在立体化学上的差别，因此对聚糖的标记和分析仍然存在不少挑战。针对这一问题，聚糖代谢标记（MGL）提供了一个较好的解决策略。其通过合成可点击的非天然糖单体，以代谢的方式通过生物自身的聚糖合成途径被掺入细胞聚糖中，随后通过Click Chemistry实现荧光团或亲和标签对非天然糖标记聚糖的特异性结合从而进行表征。通过对大量聚糖代谢标记的结果分析表明对非天然糖羟基进行预酰化可以有效提高其标记效率，但是其弊端是容易与半胱氨酸的巯基发生反应导致假阳性的结果。目前发现部分酰化，尤其是1,6-二丙酰化的非天然糖可以在具有高标记效率的同时最大限度地避免与巯基反应。因此1,6-二丙酰化的非天然糖是进行聚糖代谢标记的最佳选择。无保护的非天然糖作为可选的替代方案需要在较高浓度下才能实现较好的标记效果。但是不论是1,6-二丙酰化的非天然糖还是无保护的非天然糖单体其化学合成与纯化仍存在一定挑战，尤其是很难实现大量合成，因此这也一定程度上限制了其在聚糖代谢标记中的应用。因此针对该问题，作者提出了一种新的可点击非天然糖的简易合成策略。无保护非天然糖合成路线设计。在以往常用的无保护N-乙酰氨基己糖胺（HexNAz）非天然糖单体合成中，其主要通过使己糖胺（HexN）与卤代乙酸酐偶联，而后使用叠氮钠对卤素进行取代实现HexNAz的合成，或者使用酰胺缩合剂直接使HexN与叠氮乙酸进行缩合实现HexNAz的合成。这些方法在实际使用中均存在需要大过量使用叠氮钠的问题，造成潜在的毒性与爆炸隐患。同时这两种方法均需要硅胶色谱纯化，其纯化过程耗时长，损失高且难以实现大批量纯化。因此针对这一问题，文中提出了一个O-TMS保护策略。其中首先通过六甲基二硅氮烷（HMDS）对HexN的羟基进行全TMS化保护，在过滤蒸干后直接与NHS活化的溴乙酸进行缩合，过滤蒸干后与等当量的叠氮钠进行反应实现对溴的取代完成叠氮化。对产物进行萃取分离并蒸干后使用阳离子交换树脂进行TMS脱保护，再用乙醇对产物析出，过滤并对滤渣烘干得到终产物。整个流程并未使用到硅胶色谱进行纯化，只需要简单的沉淀就可以实现产物的分离纯化，同时也只使用了等当量的叠氮钠进行反应。在10 g规模下可以达到40%的总产率。
方案1. 通过O-TMS保护策略简易并大规模的合成无保护的可点击非天然糖1,6-二酰化非天然糖合成路线设计。1,6-二酰化非天然糖的合成建立在无保护非天然糖O-TMS合成策略中合成的TMS保护的HexNAz的基础上。当使用以N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰半乳糖胺底物合成的TMS保护的HexNAz时，直接加入酸酐进行区域选择性的硅烷交换实现1,6-二酰化。产物经萃取纯化后蒸干并通过硅胶色谱分离。而后通过阳离子交换树脂脱TMS，并再次进行硅胶色谱纯化得到最终产物。从HexN到最终产物可达到8%的总收率。方案2. 1,6-二酰化的GlcNAz、GalNAz以及ManNAz的合成。试剂与条件：Ⅰ羧酸及其对应的酸酐，吡啶，氮气，室温反应20 h。Ⅱ阳离子交换树脂，甲醇，室温反应2 h。Ⅲ乙酸铵，二氯甲烷/甲醇（1：1），室温反应16h。Ⅳ i）对应的酸酐，吡啶，氮气，0 ℃自然升至室温反应18 h。ii）阳离子交换树脂，甲醇，室温反应2 h然而在以N-乙酰甘露糖胺合成的TMS保护的ManNAz为底物时，这一方案并不能很好的实现1,6-二酰化，而是会导致3,6-二酰化。因此作者针对这一问题又开发了几种方法，如对ManNAz的2,3号位进行缩醛保护实现1,6-二酰化，以及对TMS保护的ManNAz的1,6号位进行选择性脱TMS实现1,6-二酰化等。其合成耗时略长，产率相对GlcNAz和GalNAz略低，从ManN到终产物达到5.7%的总收率。聚糖代谢标记功能鉴定。在合成了一系列1,6-二酰化非天然糖后，由于非天然糖与巯基反应是非酶促的，因此作者将合成的非天然糖与细胞裂解物进行孵育，而后与Alkyne-Cy5进行Click反应，通过胶内荧光进行分析。其结果表明1,6-二酰化非天然糖没有明显的与巯基反应的迹象，而Ac4HexNAz则均有明显条带，表明与巯基发生反应。因此1,6-二酰化非天然糖可显著降低与巯基反应造成假阳性的可能性。为了评价1,6-二酰化非天然糖在聚糖代谢标记中的效率，作者使用等量等浓度的ManNAz与1,6-二酰化的ManNAz分别对细胞进行孵育，对细胞裂解液进行胶内荧光，其结果表明1,6-二酰化的ManNAz标记效率提高了10倍以上。1,6-二酰化的GalNAc也表现出类似结果。其中对GlcNAz，由于UDP-GlcNAc焦磷酸酶（AGX1或AGX2）不能很好的耐受GlcNAz-1-磷酸，因此导致GlcNAz的标记效率相对GalNAz低很多。在HeLa和MCF-7细胞中GlcNAz和1,6-二酰化的GlcNAz都表现出低标记水平，在表达AGX2的MCF-7突变细胞中可以观察到较强的标记。总而言之，这些结果表明1,6-二酰化的HexNAz是高效且特异的聚糖代谢标记的最佳选择。图1. 1,6-二酰化非天然糖的聚糖代谢标记效率与特异性。（A-C）使用1,6-二酰化HexNAz以及Ac4HexNAz与HeLa细胞裂解液共孵育后的胶内荧光成像。（D-E）1,6-二酰化ManNAz，ManNAz以及1,6-二酰化GalNAz，GalNAz对HeLa细胞孵育后对裂解液进行的胶内荧光成像。（F）1,6-二酰化GlcNAz，GlcNAz于MCF-7细胞以及表达AGX2的MCF-7突变细胞共孵育后对裂解液进行的胶内荧光成像小鼠水平聚糖代谢标记。在确定1,6-二酰化探针具有较高的标记特异性以及良好的标记效率后，作者将其应用于小鼠体内，通过对小鼠组织裂解液进行胶内荧光，结果表明来自心，肺，脾的糖蛋白被非常有效的标记，证明了1,6-Pr2GalNAz和1,6-Pr2ManNAz可有效应用于活体动物的聚糖代谢标记。图2. 1,6-Pr2GalNAz和1,6-Pr2ManNAz对小鼠进行聚糖代谢标记。（A）使用1,6-Pr2GalNAz进行代谢标记的小鼠心，肺，脾组织裂解液胶内荧光成像。（B）使用1,6-Pr2ManNAz进行代谢标记的小鼠心，肺，脾组织裂解液胶内荧光成像。总之，本文中作者开发了一种简便的，可以应用于大量合成的更安全的非天然糖合成方法，最重要的是其使得大规模合成1,6-二酰化的非天然糖成为可能。这一工作将非常有助于无巯基结合的聚糖代谢标记应用的推广。原文引用：10.1002/chem.202203054
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