推荐一篇发表在Cell上的文章，文章标题是Dual-specificity RNA aptamers enable manipulation of target-specific O-GlcNAcylation and unveil functions of O-GlcNAc on β-catenin。其通讯作者是约翰霍普金斯大学医学院生物化学系的Gerald W.Hart，课题组主要研究O-GlcNAc修饰在信号转导和转录调控中的作用。在本文中，作者开发了一种双特异性RNA适配体，同时靶向O-GlcNAc转移酶（OGT）和Wnt信号通路的关键转录因子β-catenin，提高了β-catenin的O-GlcNAc水平，同时不影响其他OGT底物，实现了单个蛋白质上的O-GlcNAc修饰的有效调控。

O-GlcNAc是一种重要的蛋白质翻译后修饰（PTM），由两种酶进行调控：O-GlcNAc转移酶（OGT）和O-GlcNAc水解酶（OGA）。目前，很难研究O-GlcNAc在特定蛋白质上的生物学功能，任何针对它们的化学抑制剂或遗传方法都会同时改变数千种蛋白质的O-GlcNAc水平。为了解决这一问题，作者开发了一种双特异性RNA适配体（DS适配体），可以同时识别OGT和目标蛋白。

SELEX生成了靶向ncOGT的非抑制RNA适配体

首先，作者通过经过11轮SELEX，得到了靶向ncOGT的非抑制型RNA适配体T1，并通过放射性标记的斑点印迹（图1D）和表面等离子体共振（图1E）验证了其对ncOGT的识别和活性影响。结果发现，T1识别ncOGT的TPR结构域（图1F），同时不会抑制ncOGT的活性（图1G）。

接着，作者在HEK293T细胞中通过RNA-IP实验（图1H）验证了活细胞中T1和OGT的结合。同时发现，T1的表达不会改变整体的O-GlcNAc水平（图1I）。此外，相比18S rRNA在8小时处理期间稳定，T1在细胞中的半衰期很短，只有16.18分钟（图1J）。

总之，T1是一种可以结合OGT的短寿命RNA适配体，可以结合OGT而不抑制其在体外和细胞中的酶活性。

图1. SELEX生成了靶向ncOGT的非抑制RNA适配体

DS适配体增加GFP标记蛋白上的O-GlcNAc修饰

接下来，作者将T1与AP3（靶向GFP）通过linker连接（图2A），命名为NL1F。与T1单体类似，NL1F在细胞中的半衰期较短，为8.029分钟（图2B）。通过IP和WB进行定量，结果发现，与单个T1和AP3适配体相比，DS适配体将GFP-β-catenin的O-GlcNAc水平上调了2至3倍，同时，内源性β-catenin上的O-GlcNAc水平保持不变（图2C、2D，S2A–S2C），且不影响整体的O-GlcNAc水平（图S2E）。

图2. DS适配体增加GFP标记蛋白上的O-GlcNAc水平

接着，作者进行了质量迁移测定实验，将O-GlcNAc通过GalNAz标记，再通过SPAAC反应将其与8.5 kDa的PEG连接，引起蛋白质在WB中的迁移。结果发现，NL1F30和NL1F50分别使GFP-β-catenin的O-GlcNAc增加了3.3倍和2.9倍（图2E和S2F）。另外，增加GFP-β-catenin的表达会使NL1F35无效，表明适配体与底物的摩尔比对于DS适配体的功效很重要（图S2B和S2C）。

Ac4-5SGlcNAc（Ac5S）和thiamet-G（TMG）分别是OGT和OGA的高效抑制剂。在Ac5S处理的细胞中，DS适配体不会使GFP-β-catenin发生过O-GlcNAc修饰，但在TMG处理的细胞中，DS适配体可以提高GFP-β-catenin的O-GlcNAc水平（图2F和2G）。因此，OGT而非OGA的活性是适配体诱导的O-GlcNAc所必需的。同时，DS适配体不会改变OGT和OGA丰度（图3C和3D）。

除了单链连接的适配体外，作者也设计了三向的DS适配体，3JB1F和3JB1R（图2H和S2H）。结果发现，3JB1F和3JB1R分别使GFP-β-catenin的O-GlcNAc水平增加了3.5倍和2倍，同时，内源性β-catenin的O-GlcNAc水平保持不变（图2J）。

另外，作者也设计了四向的DS适配体4JC1RR（图2I）。co-IP结果显示，4JC1RR促进了OGT与GFP标记的ERα，Src和AMPKα2上的O-GlcNAc（图2L和S2K），表明DS适配体通过将OGT与目的蛋白接近来提高其O-GlcNAc水平。

总之，DS适配体能够促进OGT和GFP标记蛋白之间的相互作用，并选择性地增加这些蛋白的O-GlcNAc水平。

图S2. DS适配体增加GFP标记蛋白上的O-GlcNAc水平

O-GlcNAc通过抑制GFP-β-catenin与β-TrCP的相互作用来稳定GFP-β-catenin

β-TrCP可以将磷酸化的β-catenin募集到E3泛素连接酶上，使其被泛素化降解。在邻近连接测定（PLA）中，作者发现DS适配体抑制GFP-β-catenin和β-TrCP之间的相互作用（图3A和3B），增加了GFP-β-catenin非磷酸化部分，同时，磷酸化的GFP-β-catenin的丰度保持不变（图3C和3D）。这一结果表明，O-GlcNAc抑制GFP-β-catenin和β-TrCP之间的相互作用不是通过竞争磷酸化，而是可能通过空间位阻。

总之，GFP-β-catenin上的O-GlcNAc修饰抑制其被β-TrCP识别，并使GFP-β-catenin可以稳定存在。

图3. O-GlcNAc通过抑制GFP-β-catenin与β-TrCP的相互作用来稳定GFP-β-catenin

DS适配体增加内源性β-catenin上的O-GlcNAc水平

随后，作者测试了DS适配体是否可以调节内源性蛋白上的O-GlcNAc。首先，作者通过SELEX生成了靶向β-catenin的RNA适配体——bc339（图4A），并通过SPR表征了其结合特性（图4B），最后将该适配体通过linker与T1连接，设计得到了NL8F DS适配体（图4C）。

图4. DS适配体增加内源性β-catenin上的O-GlcNAc水平

NL8F70和NL8F100分别使内源性β-catenin的O-GlcNAc水平增加了2.3倍和1.9倍（图4D），同时，整体O-GlcNAc水平以及OGT和OGA的丰度保持不变（图S4A），表明DS适配体具有良好的选择性。另外，抑制OGT的活性可以阻止适配体诱导的O-GlcNAc（图4E）。

同样地，作者构建了具有折叠接头的DS适配体，用bc339替换3JB1F结构中的GFP适配体，设计得到了3JB8F（图4G，4H）。在Wnt不存在的情况下，3JB8F使β-catenin的O-GlcNAc水平增加了4倍（图4I和4J），在Wnt存在的情况下增加了2.5倍（图4K和4L），并可以稳定β-catenin（图S4C和S4D），同时不会改变整体O-GlcNAc水平（图S4E和S4F）。另外，与其他DS适配体类似，3JB8F需要有活性的OGT才可以诱导O-GlcNAc修饰（图S4G和S4H）。

总之，T1-linker-bc339 DS适配体特异性地增加了内源性β-catenin上的O-GlcNAc水平，并且可以在细胞核和细胞质中诱导O-GlcNAc修饰。

图S4. DS适配体增加内源性β-catenin上的O-GlcNAc水平

O-GlcNAc调节β-catenin与表观遗传修饰因子的相互作用并增加其转录活性

β-catenin是一种没有DNA结合结构域的转录因子，其功能很大程度上依赖于与其他蛋白质的相互作用，如EZH2，KAT2A。

EZH2是PRC2的催化亚基，可以催化组蛋白H3K27me3上Lys27的三甲基化，从而沉默启动子，在基因抑制和发育过程中起重要作用。PLA和co-IP结果显示，无论是否存在Wnt，3JB8F都会增加β-catenin和EZH2的相互作用（图5A，5B，5I，5J，S4M和S4N），抑制OGT则会阻止这种增加（图5C，5D，5K和5L）。另外，不改变β-catenin上O-GlcNAc水平的3JB8R，也不会影响β-catenin和EZH2的相互作用（图5E，5F，5M和5N），同时，β-catenin与H3K27me3也更为接近（图5G，5H，5O和5P）。因此，β-catenin的O-GlcNAc修饰促进了其与EZH2的相互作用。

图5. O-GlcNAc促进β-catenin与EZH2的相互作用

KAT2A是一种组蛋白乙酰转移酶，可乙酰化组蛋白H3K9ac的Lys9。与EZH2的结果类似，3JB8F增加了β-catenin和KAT2A之间的相互作用（图S5A，S5B，S5I和S5J）。

图S5.O-GlcNAc促进β-catenin与KAT2A的相互作用

β-catenin上的O-GlcNAc修饰促进其将EZH2募集到启动子上从而调节转录组

接下来，作者研究了β-catenin的O-GlcNAc水平是否影响EZH2与染色质的结合。作者使用了表达T1适体和DS适配体的HEK293T细胞，并使用核酸酶将EZH2释放。结果显示，在Wnt不存在和存在的情况下，DS适配体分别使EZH2的结合位点增加了923个和3473个（图6A-6C），说明O-GlcNAc增强了β-catenin与EZH2的相互作用，而且，这种增强的相互作用使其可以将EZH2招募到启动子上。

作者进一步研究了β-catenin的O-GlcNAc水平增加是否会影响转录组。在Wnt不存在和存在的情况下，对表达T1适配体和DS适配体的HEK293T细胞进行RNA测序。意外的是，在没有Wnt的情况下，DS适配体促进了83个基因的表达，然而当Wnt信号被激活时，DS适配体抑制了85个基因的表达（图6D和6E），即DS适配体根据Wnt信号的状态以相反的方式调节转录组。

总之，β-catenin上的O-GlcNAc增强了其与EZH2的相互作用，并将EZH2招募到启动子上。同时，β-catenin以两种方式调节转录组：在没有Wnt的情况下激活基因表达，在Wnt信号被激活时抑制基因表达，即β-catenin通过招募组蛋白修饰酶来调节基因表达。

图6. β-catenin上的O-GlcNAc将EZH2募集到启动子上从而调节转录组

将DS适配体偶联到核糖开关或Tet-On系统可以调节O-GlcNAc

最后，虽然该方法已经能够调节单个蛋白质的O-GlcNAc修饰，但是仍然存在一个问题，DS适配体结合时，OGT和底物蛋白的正常功能是否会受到干扰？适配体寿命较短的事实部分解决了这个问题，但是采用使适配体与其靶标分离的诱导机制是更为理想的手段。

于是，作者结合核糖开关设计了可诱导的DS适配体——LRS1F50C（图7A和7B），LRS1F50C中的Mango适配体可以被TO1激活。在TO1存在的情况下，TO1会与Mango适配体结合，触发其折叠，进而破坏T1和AP3的结构，使其失去功能。结果显示，LRS1F50C使GFP-β-catenin上的O-GlcNAc水平增加了3倍，而不影响内源性β-catenin的O-GlcNAc修饰（图7C-7E）。

另外，作者也使用了Tet-On诱导表达系统来控制DS适配体，该系统通过Dox控制内源β-catenin的O-GlcNAc水平（图7F）。结果显示，该系统在没有Dox的情况下诱导内源β-catenin发生O-GlcNAc修饰，在添加Dox后活性丧失（图7G和7H）。

总之，借助核糖开关和Tet-On系统，作者证明了DS适配体可以通过诱导机制对蛋白质进行特异性的O-GlcNAc修饰调控。

图7. 通过将DS适配体偶联到核糖开关或Tet-On系统来调节O-GlcNAc修饰

总之，作者开发了一种可以诱导蛋白质特异性O-GlcNAc修饰的DS适配体，这种适配体不会改变OGT或OGA的活性。使用这一DS适配体，作者发现O-GlcNAc修饰能够调整β-catenin与其他蛋白质的相互作用来影响其功能。

文章作者：CXY

DOI：10.1016/j.cell.2022.12.016

责任编辑：LD