今天介绍的文章来自JACS，文章的标题是“Photoproximity Labeling of Sialylated Glycoproteins (GlycoMap) Reveals Sialylation-Dependent Regulation of Ion Transport”，通讯作者是来自美国普林斯顿大学大学的David W. C. MacMillan教授。MacMillan教授的研究方向是追求催化新概念：有机催化、级联、协同、光氧化还原和金属光氧化还原催化及其在天然产物和药物全合成中的应用，以及利用光催化研究复杂的生物环境。MacMillan教授因“不对称有机催化的发展”相关研究获得2021年诺贝尔化学奖。

糖基化是蛋白质最常见的翻译后修饰之一，可以改变蛋白质的定位和功能，而唾液酸因为对细胞功能影响特别大而受到科学家广泛关注。目前唾液酸相关的生化机制仍然知之甚少，部分原因是缺乏高分辨率工具来评估唾液酸化的功能作用，因此需要新的方法来分析唾液酸化的生化影响。本文中作者开发了称为 GlycoMap 的策略，将铱 (Ir) 光催化剂精确引入细胞表面糖蛋白上并与非天然糖代谢的叠氮唾液酸相结合。使用蓝光照射细胞局部，铱光催化剂会将biotin-diazirine探针氧化产生卡宾并标记糖蛋白及其周围蛋白。这种策略的优势有：引入的邻近标记机制具有高度选择性(铱标记仅限于唾液酸)、与酶促邻近标记策略相比更小的标记规模、催化标记的性质允许信号放大，以及对糖蛋白标记的精确时空控制。

图1. 利用聚糖微环境(GlycoMap)揭示唾液酸化细胞表面糖蛋白的相互作用组

作者首先探究优化了铱催化剂的唾液酸标记(图2A)。用Ac4ManNAz孵育 HeLa 细胞，再用 DBCO-Ir处理使铱光催化剂结合到糖蛋白上。在存在biotin-diazirine的情况下进行照射会导致细胞表面生物素化，如蛋白质印迹(图 2B)所观察到的。当省略叠氮基糖、DBCO-Ir试剂或蓝光照射时，对照组表现出最小的生物素化。使用链霉亲和素珠(streptavidin bead)的免疫沉淀结果(图 2C)显示唾液酸化糖蛋白 nicastrin (NCSTN) 和补充衰变加速因子 (CD55) 的富集，证明了对糖蛋白的标记目的。

图 2. 用于唾液酸化糖蛋白的光临近标记的方法优化

作者进一步开发了基于串联质量标签 (TMT) 的定量化学蛋白质组学方法，以鉴定唾液酸化的细胞表面糖蛋白并绘制它们的相互作用组图 (图 3A)。对于每种细胞类型，作者使用三种不同的条件进行了比较实验：条件A使用 SPAAC 和 DBCO-biotin并仅导致唾液酸化糖蛋白的生物素化、条件B 使用 SPAAC 和 DBCO-Ir 对唾液酸化糖蛋白及其邻近蛋白质进行生物素化，以及在没有叠氮糖的情况下使用 DBCO-Ir进行了对照实验。这些条件允许识别 (1) 唾液酸化糖蛋白，(2) 唾液酸化糖蛋白及其邻近蛋白质，以及 (3) 选择性识别细胞表面唾液酸的蛋白质相互作用。在HEK293T 细胞上应用条件 A，作者发现 363 种蛋白质显着富集，其中 93% 是已知的糖蛋白，包括NCSTN 、CDH2、SMAGP、CD47、BSG、CD166、CD99和NPTN。条件 B富集了唾液酸化糖蛋白和其临近蛋白，因此与条件 A(对比对照)中富集的蛋白质有约 65% 的重叠。对 GlycoMap 生成的唾液酸相互作用组的分析表明，81% 的富集蛋白与膜相关，反映出标记方法的准确性。

图 3. (A) 基于 TMT 的化学蛋白质组学以及唾液酸化糖蛋白相互作用组的工作流程；(B) 通过 HEK293T 细胞的糖图谱进行定量化学蛋白质组学验证

针对构建好的方法，作者接下来研究肿瘤发生中的过度唾液酸化事件，对原发性宫颈癌细胞 (PCC) 和 HeLa 宫颈腺癌细胞系进行了 GlycoMap 比较实验(图 4 A)。化学蛋白质组学分析显示 HeLa 细胞中的唾液酸化蛋白数量明显高于 PCC(图 4A)。HeLa 细胞中唾液酸化糖蛋白的增加导致了更多数量的蛋白相互作用 (HeLa 细胞中166 种与PCC中63 种)。当比较已知的唾液酸相互作用蛋白的功能时，与小分子转运相关的功能在 HeLa 细胞中出现更多次 (有机离子转运、小分子转运、维生素转运)，以及更多的溶质载体蛋白 (SLCs) 在HeLa细胞中富集(图 4C)。特别是，唾液酸化蛋白与“与乙醇胺、肉碱和锌离子转运相关的SLC”的相互作用在 HeLa 细胞中比PCC显着丰富。

最后，作者应用酶促反应研究唾液酸化蛋白的功能(图 5A)。从霍乱弧菌分离的唾液酸酶(VC-Sia)处理 HeLa 细胞可以有效切割与细胞表面聚糖相连的α2,3-、α2,6- 或α2,8-唾液酸，在是否添加VC-Sia 的情况下孵育 HeLa 细胞，然后对细胞代谢物提取物进行基于质谱的代谢组学定量。唾液酸酶处理的细胞中大多数代谢物水平受影响最小，但乙醇胺衍生物的水平显着增加，包括胞苷二磷酸乙醇胺 (CDP-Etn)、磷酸乙醇胺 (P-Etn) 和胞苷二磷酸胆碱 (CDP-choline) (图 5B)。负责乙醇胺转运的溶质载体蛋白，类胆碱转运蛋白1 ( SLC44A1 )，在之前的工作中不确定是否被糖基化，但文本中数据集表明其功能可能受相邻唾液酸化糖蛋白的调节。基于这些结果，作者假设细胞表面唾液酸可能在膜结合转运蛋白周围呈现带负电荷的表面，进而影响离子以及一些代谢物离子的转运。在唾液酸化对锌摄取的影响实验中表现出类似的结果(图 5C)，锌由 SLC39 家族的一系列溶质载体蛋白通过细胞膜输入，HeLa数据集显示了其中四种蛋白 (SLC39A6、SLC39A8、SLC39A10 和 SLC39A14) 被唾液酸化，一种蛋白 (SLC39A1) 与唾液酸化糖蛋白相互作用。锌是一种关键的微量营养素，它的运输在许多癌症中失调。使用比色法测定VC-Sia处理的 HeLa 细胞的锌水平，发现用酶处理的细胞中的锌水平明显更高，表明细胞表面唾液酸化和/或与唾液酸化糖蛋白的相互作用在细胞锌浓度的调节中发挥作用。