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今天介绍的文章来自JACS Au，文章的标题是“Organelle-Selective Membrane Labeling through Phospholipase D-Mediated Transphosphatidylation”，通讯作者是来自美国康奈尔大学的Jeremy M. Baskin副教授。Baskin组的主要研究方向是探索脂质和膜生物学的开创性创新化学方法，重点是开发新的分子成像工具和阐明与人类疾病相关的生物学机制。
传统的细胞器标记，一种方法是令荧光蛋白与细胞器靶向肽段或结构域的基因融合，虽然被广泛使用，但需要转染或基因修饰；另一种方法是，多数细胞器可以使用小分子染料靶向其独特的生理特性，然而这些探针大多是基于人工设计，它们不太适合测量细胞器动态的相互作用，包括细胞器间膜接触位点和细胞内脂质转运等。 相反，一种不同的策略使用代谢标记和生物正交化学对膜的丰富脂质成分进行共价标记。炔基胆碱是胆碱的类似物，通过Kennedy 途径生物合成转化为炔基磷脂酰胆碱（PC），进一步使用CuAAC或SPAAC标记在细胞中显现（图1）。由于 PC 无处不在且丰富，这种方法基本适用于标记所有细胞器膜。
图1. 使用PLD活性设计和使用叠氮胆碱类似物对细胞器膜进行荧光标记。
本文中，作者试图对细胞器膜进行选择性染色，其中细胞器选择性可由结构上些许不同的胆碱类似物赋予，这些胆碱类似物可以通过代谢标记步骤引入。由此产生的脂质类似物相对于天然脂质的干扰最小，但它们的不同运输行为和定位随后可以在生物正交标记反应引入荧光标记后可视化。因此，作者通过用各种烷基取胆碱上N-甲基，设计并合成了一组具有不同大小和亲水性的叠氮胆碱类似物（2 - 4，图1）。如果这些探针可以并入相应的 PC 类似物中，它们不同的物理化学特性可能赋予这些生物正交脂质不同的运输特性和细胞器膜亲和力，从而实现使用单一荧光团试剂的多功能细胞器选择性成像。
OCT1 辅助生物正交胆碱类似物的代谢标记
表1：1-PC – 4-PC的 LC-MS 表征
用 hOCT1-miRFP 转染 HeLa 细胞，使用BCN-BODIPY进行SPAAC标记后通过共聚焦显微镜观察，作者发现用2成功进行代谢标记，并将这一过程称为“通过转磷脂酰化作用与可点击醇对磷脂酶 D活性进行成像”（IMPACT，图1 B和2 A）。作为对照，作者在 HeLa 细胞中表达了另一个可转运不同类型代谢物但不会转运带正电荷的化合物的人类单羧酸转运蛋白1 （MCT1），发现 MCT1 无法实现胆碱类似物2的IMPACT标记（图 2 B）。 图 2.用胆碱类似物2对 HeLa 细胞进行 IMPACT 标记需要 hOCT1 表达。
BODIPY-PC 类似物的细胞内定位
在检查 BODIPY 标记的 PC 类似物的细胞内分布后，作者观察到不同的亚细胞定位，进一步使用细胞器标记进行详细的共定位分析（图 3）。在HeLa-hOCT1 细胞中BODIPY-1-PC与 ER 和高尔基体标记物表现出强烈的共定位（图 3A），并且与线粒体、溶酶体和质膜标记物几乎没有重叠。相比之下，尽管与BODIPY-1-PC的唯一区别在于两个N-甲基延伸为N -乙基，BODIPY-2-PC与 ER 和高尔基体的共定位显着减少，与线粒体标记强烈共定位（图3B），并与溶酶体标记适度共定位。进一步延伸至N-丙基， BODIPY-3-PC呈现出高度选择性的线粒体和溶酶体标记（图3C），并几乎完全丧失 ER 和高尔基体标记。最后，BODIPY-4-PC的大小与BODIPY-3-PC相似，但亲水性更强，主要定位于线粒体（图 3D），在 ER 和高尔基体处有小区域（图 3D)。 图 3. 共定位分析揭示了来自1–4的 BODIPY 标记的 PC 类似物的不同亚细胞定位。
BODIPY-PC 类似物的动态运输行为
通过使用 ER 和线粒体标记物监测BODIPY-1-PC、BODIPY-2-PC和BODIPY-3-PC在1 小时内的共定位，我们发现BODIPY-1-PC保留了其 ER 而不是线粒体定位（图 4 A、D），而BODIPY-3-PC相反地保留了其线粒体定位而不是 ER 定位（图 4 C、F）。BODIPY-2-PC表现出中间但稳定的表型，与两种标记部分共定位（图 4 B、E）。这些时间序列研究表明 BODIPY-PC 类似物至少可稳定一小时。 图 4. BODIPY 标记的 PC 类似物的亚细胞定位在 1 小时内稳定。
更长时程的结果显示出，荧光团标记的1 - PC最终在 SPAAC反应后随时间转移到其他细胞器，而BODIPY-3-PC没有表现出类似的细胞内迁移趋势。在 SPAAC 后 24 小时的孵化过程中（图 5A），BODIPY-3-PC在线粒体的标记非常稳定（图 5 B，C），这意味着BODIPY-3-PC缺乏从线粒体到其他细胞器膜的转移机制，并突出了它对线粒体膜长期标记的效用。 图 5. BODIPY-3-PC对线粒体的亚细胞定位在 24 小时内保持稳定。 总之，作者开发了一系列生物正交胆碱类似物，可以产生独特细胞器膜的稳定代谢标记，并且在某些情况下可以报告细胞器间脂质转运途径。这一进展的关键是OCT1 的异源表达使细胞能够输入阳离子胆碱类似物，可用于小阳离子货物的细胞溶质递送，并引入细胞不可渗透的探针。从1-4生成的 PC 类似物通过 PLD 转磷脂酰化采用不同的亚细胞定位并表现出不同的细胞内转运行为。结构上更接近天然 PC 的类似物主要定位于 ER 和高尔基体，而那些具有较长N-烷基链的类似物优先在线粒体中积累。作者设想这些探针的使用不仅用于细胞器-细胞器间脂质转运的选择性成像和监测，还可能通过在定义的亚细胞膜环境中束缚生物活性小分子，以细胞器水平的精度局部调节生理事件。 本文作者：HBQ 原文引用：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.2c00419 责任编辑：LD
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