今天跟大家分享一篇发表在bioRxiv杂志上的文章，题目为“A Simple Method to Dual Site-Specifically Label a Protein Using Tryptophan Auxotrophic Escherichia coli”。（提醒：发表在该杂志的文章并没有经过同行评审）文章的通讯作者是来自加州大学圣地亚哥分校化学与生物化学系的Simpson Joseph教授，他们课题组的主要方向是蛋白质合成的机理研究、调节基因表达的转录后机制以及病毒的翻译控制研究。本文提出了一种简单的方法，通过使用大肠杆菌的色氨酸营养缺陷型将色氨酸类似物5-羟基色氨酸引入到重组蛋白中，并实现双位点特异性蛋白质标记。

作者首先建立了一个重组蛋白的表达方案，如图1，选择色氨酸营养缺陷型大肠杆菌BL21(λDE3)/NK7402，将色氨酸类似物特异性插入到蛋白质中。表达质粒转入到Trp营养缺陷型大肠杆菌中后在含有正常色氨酸的基础培养基中生长。一旦细胞生长到所需的生长密度以后，清洗掉基础培养基，加入含有色氨酸类似物的新鲜培养基以及诱导剂。富集细胞后，进行蛋白纯化。含有色氨酸类似物的重组蛋白随后可以用相应的生物偶联方法进行标记。

图1、利用色氨酸营养缺陷型大肠杆菌将色氨酸类似物引入重组蛋白进行双位点特异性标记的方案。

本文中作者的模型蛋白是大肠杆菌的RF1，它显示两种不同的构象—Open（开放）构象和Close（闭合）构象。选用野生型大肠杆菌RF1中位于结构域III的半胱氨酸（C257）和位于结构域II的色氨酸（W144）。根据该模型，这两种残基在闭合和开放状态下的距离分别为24Å和49Å（图2B和2C）。根据结构模型中任意两个残基的α-碳的相对位置计算得出（图2D），C257/W144对不会影响GGQ和PXT基序的生物功能。距离图进一步转换为二维图，显示基于荧光素和四甲基罗丹明的FRET效率的变化（图2E）。FRET效率图显示，当用荧光素和四甲基罗丹明标记时，C257/W144对可能显示FRET效率的显著变化。

图2、大肠杆菌释放因子1（RF1）在开放和闭合构象中的结构图

选定位点以后，作者将5-羟基色氨酸（5HW）引入到RF1的W144的位点中。荧光光谱显示，5HW-RF1在310nm激发时在340nm处显示出强发射，而Trp-RF1则没有。LC-ESI-TOF质谱分析表明，Trp-RF1和5HW-RF1之间完整蛋白质质量的差异正好是16，即氧原子的原子质量，这表明重组scswRF1蛋白质中成功掺入了一种且仅一种5-羟基色氨酸。

图3、将5-羟基色氨酸引入到单个半胱氨酸和单个色氨酸的RF1中。

scswRF1蛋白上用一个荧光团标记半胱氨酸残基，另一个荧光团标记色氨酸类似物。对于5-羟基色氨酸位点，5-氨基荧光素（FLA）可在温和氧化条件下共价连接到吲哚环上，而半胱氨酸用四甲基罗丹明（TMR）-马来酰亚胺标记(图4A)。为了确定标记反应的特异性，scswRF1用FLA （RF1-F）或TMR（RF1-T）标记，用FLA和TMR（RF1-FT）双重标记。电泳分离标记的蛋白质，用Typhoon扫描仪扫描凝胶的荧光信号（FLA在488 nm处激发，525 nm处发射；TMR在532 nm处激发，570 nm处发射）。从图4B中观察到，蛋白成功被FLA或TMR标记，双标记的scswRF1s的染料也表现出预期的结果。并用光谱图进一步验证了标记结果（图4D）。

有了单标记和双标记的蛋白，作者用实验检验了 RF1的close状态中是否存在FRET（图4C）。结果显示，与两个单标记蛋白质的信号之和（图4D，黑色虚线）相比，RF1-FT光谱中520nm处的FLA发射峰稍低，575nm处的TMR发射峰稍高，表明RF1蛋白质中存在小的FRET信号。

图4、位点特异性双标记5HW-RF1和光谱分析

虽然作者证明了RF1是用两种不同的染料特异性标记的位点，并且观察到了一些FRET现象，但可能由于位点选择不是最佳，所以无法对该动态特性提供进一步的解释。此外该方法与扩展遗传密码的非天然氨基酸插入相比，还是有一定的局限性，比如只能引入色氨酸类似物、蛋白质中的色氨酸为活性氨基酸时不能改动等。但是可以为研究人员们在设计蛋白标记的时候多一种选择。

文章作者：YJ

原文引用：10.1101/2021.11.04.467337

责任编辑：LD