多肽和蛋白质类药物的出现，极大地推进了许多临床疾病的治疗，以胰岛素为例，其对糖尿病的治疗意义是里程碑式的。然而，天然胰岛素在临床应用上存在诸多局限性，如在血浆中半衰期短、单次注射易导致低血糖等¹。对胰岛素结构和功能的研究表明对肽链进行修饰可以有效地对胰岛素多方面的性质进行优化 (图1)。目前已上市的胰岛素类似物，如地特胰岛素 (insulin detemir) 和德谷胰岛素 (insulin degludec)，就是通过对胰岛素B链的K29 (后文简称B29) 进行修饰来达到改善药代动力学特性的目的²。相比之下，对于其他潜在的修饰位点，如A链N-端的G1 (后文简称A1) 和B链N-端的F1 (后文简称B1)，目前并没有适用于量产和工业化的修饰策略。

2022年6月17日，来自默克的Anna Fryszkowska和Cuihui An共同通讯，在Science上发表题为A chemoenzymatic strategy for site-selective functionalization of native peptides and proteins的论文，通过酶的定向进化，实现了对胰岛素特定位置氨基的高效、特异性修饰。在此基础上，以特定位点上的修饰作为保护基团，实现对两种临床前胰岛素二聚体的合成，在缩短了合成路线的同时，极大地提高了终产物的纯度和产量 (图2)。

此前研究报道，E.coli的青霉素G酰化酶 (penicillin G acylase, PGA) 能够催化肽链上N-苯乙酰水解，但由于EcPGA活性较低，其在蛋白功能化修饰中的应用始终受限³。通过在文库中对100多种商品化的PGA同源蛋白进行筛选，研究人员发现来自于Kluyvera cryocrescens的PGA (KcPGA) 具备同时水解A1、B1和B29上苯乙酰基的能力。当反应时间足够长时，3个苯乙酰基均会被水解，但整体反应速率B29＞A1＞B1。通过对KcPGA进行定向进化，其水解苯乙酰基的选择性可以得到极大的增强，能够特异性产生B1、A1+B1以及B1+B29等不同位点存在修饰的胰岛素 (图3)。

PGA对苯乙酰基的水解是一个可逆反应，在特定的条件下能够催化氨基的苯乙酰化。通过定向进化，研究人员得到了能够直接催化特定位点氨基酸修饰的PGA突变体 (图3)。至此，利用上述功能趋异的PGA突变体，能够催化得到各种在特定位点修饰的胰岛素。此外，本文还对这些PGA的晶体结构进行了解析，发现大多数突变位于催化活性位点附近的loop区以及蛋白表面。

在后续的工作中，研究人员将N-苯乙酰修饰作为保护基团，利用A1-(苯乙酰)胰岛素和B29-(苯乙酰)胰岛素进行MK1092和MK5160的合成，二者均为基于胰岛素的耦合物，具有较好的应用前景。结合对PGA的进一步定向进化，MK1092和MK5160的合成步骤得以简化，且产量和纯度均有极大的提升 (图4)。

综上，本文的工作为量产具有特定位点修饰的胰岛素类似物奠定了一定的基础，该设计思路在其他蛋白类药物，如IL-2的修饰和量产上同样具有一定的前景。