分享一篇2021年6月发表在science上的文章，文章的题目是“Ubiquitinationis essential for recovery of cellular activities after heat shock”，通讯作者属于霍华德休斯医学研究所以及圣朱迪儿童医院，该课题组致力于研究phasetransition的分子机制，理解其在组织细胞内的作用，更多的关注其在神经退行性疾病的作用。该研究所具备各类生物实验条件，故研究手段并不局限，本文所采用的主要为蛋白质组学技术、基因操作以及细胞成像等。 当面对环境压力时，细胞会关闭一些生物活动，如翻译和核质转运等。应激颗粒(stressgranules)是细胞应对环境压力所产生的蛋白和RNA的结合物，许多细胞蛋白被共价加入的泛素修饰，这长期以来被认为反映了压力损伤蛋白的降解。一些研究表明，在不同的外界压力下，细胞会产生不同的泛素化模式。这种泛素化并不是反映应激损伤蛋白质的降解，而是在应激消除后，应激颗粒解聚并重新启动正常的细胞活动。为了探究泛素化在应激反应中的作用，研究者们使用了串联泛素结合实体(TUBE)蛋白质组学技术，对哺乳动物细胞施加了5种不同类型的压力，对其泛素蛋白组进行分析（实验概览如下图所示）。 研究者们对HEK 293T细胞进行了5种应激处理，分别为热休克、氧化、渗透压、紫外线(UV)和蛋白酶体抑制，共鉴定到500种泛素化蛋白，每种应激条件下200-300种。每一种压力表现出不同的泛素化组的模式(pattern)，并且绝大部分泛素化蛋白的响应仅发生在一种应激条件下，尤其是热休克引起的泛素蛋白丰度的增加显著。图2 每种应激反应的泛素化组热图(左)以及5种条件的上下调蛋白数目(右)2． 热休克引起的泛素蛋白质变化较为快速且响应特殊为了研究蛋白质水平表达的变化，研究者们继而采用多重串联质谱(TMT)对蛋白酶体抑制剂存在有无的情况下，热休克与氧化应激的蛋白质组变化，定量了12586种蛋白质数据中，只有8个蛋白质的泛素化依赖性增加显示显着减少，其中3个蛋白质(EPPK1,GCN1,CYP51A1)在加入硼替佐米后在热激条件下稳定下来，表明它们是热应激依赖性蛋白酶体降解的靶蛋白。应力依赖的泛素化增加并没有导致总蛋白水平的全面下调。同样，RNA-Seq结果表明，大多数热激组基因在转录水平上不受调控，虽然热休克的转录反应可能对较长时间范围内从压力中恢复有重大贡献，但它似乎并不直接参与本文所研究的压力反应活动的短期逆转。3． 热休克引起的泛素蛋白质变化较为快速且响应特殊通过对TMT与di-Gly富集联用，对泛素位点进行定量分析，发现除 k6外，所有多聚泛素连接类型的热激依赖性增加。许多蛋白质在持续热应激期间的泛素化，最终被蛋白酶体降解。GO分析显示，热休克泛素组在细胞应激时下调或关闭的生物学途径中高度富集。另外，转录因子的富集定位到应激颗粒，进一步将泛素化与下调的细胞活动和应激颗粒联系起来，破坏了核质转运。4． 信使核糖核蛋白(mRNP)复合物在热休克恢复后重塑热激引起的泛素化组数据中，大部分是mRNP相关的蛋白。研究者们继而采用与Oligo-dT捕获 mRNPs，并进行免疫印迹以证实了多聚体结合蛋白的mRNA的存在。这表明泛素化可能发生在组装的复合物上，而不是在单个RNA结合蛋白上。另外，内源性蛋白co-IP实验结果中超过一半的蛋白质(59/103)表现出热应激依赖性增加，且与TUBE实验中蛋白质的丰度高度相关，说明应激颗粒是通过直接的、多聚泛素介导的相互作用而稳定。图5. 热休克后mRNP重塑的WB(左)、相关分析(中)以及co-IP结果热图(右) 为了进一步研究多聚泛素缀合物与应力颗粒动力学的关系，加入抑制剂TAK243，结果表明消除泛素化并不能阻止热休克时应激颗粒的形成，但是在应激消除后应激颗粒的分解受损。因此，泛素化可能是从热休克恢复过程中应力颗粒能够正常分解的关键。 采用tdTomato技术分析细胞核和细胞质之间穿梭。TAK243处理的细胞即使恢复正常生长条件2小时也不能从受损的核浆穿梭中恢复。因此，类似于应力颗粒的分解和mRNP 重塑的逆转，泛素化对于热应激后核浆穿梭的恢复是必不可少的。图6. mRNP重塑中的核质穿梭免疫荧光(左/上)及其定量分析(右/下)蛋白质的合成也受到热应激的强烈干扰，这是由于大多数翻译的广泛关闭，除了热休克蛋白的翻译被保留。为了研究泛素化在应激诱导的翻译扰动中的作用，嘌呤霉素与新生的翻译产物的结合程度显著降低，随后在恢复正常生长条件后出现依赖时间的恢复(图7)。TAK243处理的细胞在恢复正常生长后，蛋白质合成明显恢复失败。因此，泛素化对热休克恢复期翻译的恢复至关重要。图7. mRNP重塑前后的嘌呤霉素WB检测(左/上)及其定量分析(右/下) 总之，上述研究结果表明，热应激诱导一组特定蛋白质的靶向泛素化，这种泛素化是从多重热应激诱导的细胞扰动中恢复所必需的，包括逆转mRNP 重塑、应激颗粒分解、恢复核质转运和蛋白质合成。 应激诱导泛素化的适应性的某些方面早已被认识。特别是对于蛋白毒性的损伤，需通过泛素化蛋白酶体降解来去除。另外，细胞面对外界压力产生的应激颗粒的机制尚未充分明确，作者自述其研究结果为细胞应激过程揭示了一些维度的考量：首先，蛋白质组全局模式的改变是针对特定的压力因素而定制的，热休克应激的情况下，这种全局变化为细胞的恢复提供了前提条件。此外，泛素化在热激或氧化诱导的应力颗粒之间的关系的直接比较突出二者的重要差异。最后，一个深度而多面的泛素化组，为后续研究提供了重要的资源，可对泛素化在应激颗粒方面的机制展开更深入的探索。原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abc3593原文引用：10.1126/science.abc3593
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