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赏析一篇酶催化顶刊文献。由Merck和Codexis合作发表于Science杂志，主要实现了对胰岛素氨基的选择性修饰。
本文做了什么
胰岛素有三个氨基，A链N端的A1，B链N端的B1，B链29位赖氨酸的B29。本文的具体做法，借鉴了有机化学中常用的保护基化学。具体过程如下图。胰岛素（或者全保护的胰岛素）作原料，经过一步酶催化的位置选择性保护/脱保护，获得特定氨基保护的胰岛素。这时就可以用化学法做任意想要的连接（本文做的是二聚化合成俩药物）。最后脱保护。
整个流程的核心部分，就是酶催化的位置选择性保护/脱保护，也就是上图中 1 或 2 经酶催化生成 3 的过程。全文大部分实验也都在实现这一步。作者先用三保护的底物 2 ，做选择性脱保护反应。筛选了100多个商业化的青霉素G酰胺水解酶，获得了两个酶，位置选择性比较好。
这俩酶是来自Achromobacter sp.的PS150和PS750，可以选择性水解A1和B29位的酰胺保护，拿到B1位保护的胰岛素。下图左侧上数第一个产物3a。
剩下的酶的位置选择性就都差点意思了。矮子里面拔将军，还有一个来自Kluyvera cryocrescens的KcPGA。KcPGA水解底物 2 的偏好是B29 > A1 > B1。
以上是筛选的情况。下面作者就用定向进化的方法，把KcPGA变得更好，最终可以合成任意组合的氨基保护胰岛素。
KcPGA这个酶，不太适合直接做定向进化。主要原因有两个。一是它是一个异源二聚体。二是它的形成经过了一个自剪切过程。具体见下图。对应这两个原因，作者做了分子上的操作，一是加一个linker把二聚体连起来，二是把自剪切要掉下去的部分去掉。这样形成的序列叫PGA(Rd0)，就方便做定向进化了。
通过重新链接的方式优化PGA的表达
• 经过四轮定向进化后，得到一个PGA(B29-H)(Rd4)，水解B29选择性达到99%，这样就能拿到A1和B1保护的胰岛素了。
• 另外两轮定向进化后，得到一个PGA(A1-H)(Rd3)，水解A1选择性达到95%，这样就能拿到B1和B29保护的胰岛素了。
• 作者觉得先化学保护，后水解掉，多余一步，不美。而水解反应是可逆的，再改造理论上能得到催化酰胺化的酶。
• 进化三轮，得到PGA(A1-Ac)(Rd3)，酰胺化A1，产率92%，选择性98%，拿到A1保护胰岛素。
• 继续进化，得到PGA(B29-Ac)(Rd6-CHis)，酰胺化B29，拿到B29保护胰岛素。
• 进化，得到PGA(A1B29-Ac)(Rd3-CHis)，酰胺化A1和B29，拿到A1和B29保护胰岛素。
• 至此，所有六种单位点保护和双位点保护的胰岛素，都可以通过酶催化保护/脱保护获得。
具体进化情况见下表：
接下来，作者用这些酶作为工具，合成了两个胰岛素衍生物药物，MK-1092和MK-5160。其中保护和脱保护用酶法，其它步骤用化学法。具体路线见下图。
这俩药物是胰岛素二聚体，作者又定向进化出了水解二聚体上所有保护的突变体，PGA(global-dimer-H)(Rd3-CHis)。
其中MK-1092的合成，做了一个产量大于120g的反应，纯度82%，分离产率73%。这在酶催化肽或蛋白修饰领域绝无仅有。
最后，作者试了在其它肽/蛋白上的效果。对胰岛素类似物Glargine的A1转化率和选择性都不错。对Melittin的N端也不错。Glucagon转化率低。Apamin和Somatostatin基本不反应。具体见下图。
亮点与意义
1. 当多肽上有多个pK(a)类似的氨基时，使用酶法选择性酰胺化修饰特定位置的氨基；或选择性水解特定位置的酰胺。 2. 极大地提高了多肽/蛋白N端修饰的反应量级，120g级的合成，相当罕见。 3. 胰岛素是极为重要的药物，对其选择性修饰对药物领域有重要意义。 4. 选择性保护及脱保护，对合成其它类型胰岛素酰胺修饰物有一定广谱性。
启示
1. 评估蛋白底物特异性，目前还只能靠实验方法直接筛选。蛋白蛋白对接领域，需要更多的进步，才能有效指导这方面的实验。可能需要有主动生成式的采样手段来克服巨大的采样空间，尽量少采样。 2. 定向进化，威力巨大。从种群遗传学角度，库的大小和多样性非常重要（取极端情况，只有一个突变和覆盖所有单点突变，后者显然更能筛到好的），应该在检测条件尽量准确的情况下，能做到更大的库。 3. 科学上可能会追求一些明显的质变，例如全酶法，或者一步酶法这种手段，但是可能拿到的产物量少，条件苛刻。工程上更多的是量变引起的质变，这边提高一点选择性，那边进化一下活性，然后优化一下化学反应，最终产量也上去了成本也控制住了。 参考文献
Fryszkowska et al., Science 376, 1321–1327 (2022)
https://www.science.org/doi/10.1126/science.abn2009
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