化学蛋白质修饰已成为化学生物学基础和转化研究的宝贵工具。特别是在蛋白质递送应用中，理想的修饰是“无痕的”，即不会留下可能对结构或功能产生有害后果的原子。但现存的生物可逆策略库很少。Cys和Lys残基一直是化学蛋白修饰的主要靶标，一种常见的方法是通过混合二硫键将配体连接到Cys上，然后在细胞质中还原。然而，Cys在人类蛋白质中的丰度很低（2.4%）并且经常被螯合在疏水区域或二硫键中，因此无法进行改性。与Cys相比，Lys更丰富（5.0%）且溶剂可及，研究人员发展了一些新兴策略用于可逆地修改 Lys。尽管如此，无痕蛋白质修饰的可用选项很少，并且较难实现模块化。人类蛋白质中Glu（6.4%）和Asp（4.5%）残基的高丰度和溶剂可及性使羧基（共10.9%）成为偶联的一个有吸引力的目标。在此，作者介绍了一种基于化学选择性、模块化和生物可逆的蛋白质羧基修饰策略。

近日，麻省理工学院的Ronald T. Raines教授和他的团队在《J. Am. Chem. Soc.》发表了一篇题为“Modular Diazo Compound for the Bioreversible Late-Stage Modification of Proteins”的研究论文。在该研究中，作者介绍了蛋白质生物可逆修饰的一种通用策略。该策略基于一种三组分分子，分三步合成，其中包括一个重氮基团，用于羧基的化学选择性酯化；一个吡啶基二硫基团，用于与硫代配体的后期功能化；以及一个可自裂解的碳酸酯基团，用于酯酶介导的裂解。以细胞色素c（Cyt c）和绿色荧光蛋白（GFP）作为模型，作者合成了具有不同结构域修饰的蛋白质偶联物用于细胞递送，可递送物包括小分子、靶向和细胞穿透肽（CPPs）以及大多糖。作为概念验证，作者使用他们的策略在血清存在下将蛋白质递送到活的哺乳动物细胞的细胞质中。功能化Cyt c会诱导细胞凋亡，其细胞递送突出了羧基的生物可逆偶联相比于氨基上不可逆偶联上的优势。这种无痕修饰的便利性和实用性为化学生物学家提供了新的机会。

图1  A）重氮化合物1的设计，其三个结构域以不同的颜色突出显示。（B）蛋白质羧基的生物可逆后期修饰方案。

Scheme1  重氮化合物1和2的合成途径。

图2  （A） 1和HS-cR₁₀的模型蛋白和结构。（B,C）无活性Cys残基和有活性Cys残基蛋白质的标记策略。标记方案下显示相应的Q-TOF MS数据。数字+1等为标签数量;“max x”为标签的最大数量;“WT”是指天然蛋白。

图3  酯酶切割。（A）PLE介导的MGA-1裂解的LC-MS分析。（B-D）GFP-1-TAT，Cyt c-1-cR₁₀和 Cyt c-2-cR₁₀用PLE孵育之前和之后的Q-TOF MS 数据。“WT”是指天然蛋白质。

图4  蛋白质的细胞递送。（A）通过cR₁₀生物可逆修饰递送胞质蛋白的假定机制。n指羧基的总数；x是指酯标记的数量。（B）5μM（i）GFP、（ii）GFP–1–cR₁₀ 、（iii）Cyt c-F和（iv）Cyt c-F-1-cR₁₀在补充FBS的DMEM存在下与活HeLa细胞孵育1.5小时（i，ii）或M21细胞孵育2.5小时（iii，iv）的成像图。（C）用Cyt c（浅灰色）、Cyt c-BCN-cR₁₀和Cyt c-1-cR₁₀（红色）处理21小时后M41细胞的活力。

该团队开发了一种通用的后期蛋白质偶联策略。此方法不需要rDNA技术，在温和条件下完成修饰，且标记的数量可调。通过酯酶介导的甲基醌形成可以实现无痕量释放，修改支架以允许其他触发器（包括小分子）释放。从本质上讲，该策略能够在几乎任何蛋白质上生物可逆地安装二硫键和巯基。它在蛋白质的无痕细胞传递方面的效用是十分突出。该策略在其它方面的应用，如用靶向配体和药代动力学增强剂对感兴趣的蛋白质进行可逆性装饰，也是可行的。简而言之，该团队开发了一类新的探针，填补了现有蛋白质修饰策略的空白。

Ronald T. Raines

教育工作经历：

理学学士， 化学 — 麻省理工学院

理学学士， 生物学 — 麻省理工学院

硕士，化学 — 哈佛大学

博士，化学 — 哈佛大学

博士后— 加州大学旧金山分校

教授，罗杰和乔治·芬美意（Roger and Georges Firmenich）天然产物化学—麻省理工学院

科研简介：

Raines小组以原子细节阐明蛋白质结构和蛋白质功能的化学基础和生物学目的，他们尝试深入了解氨基酸序列与蛋白质功能（或功能障碍）之间的关系，以及创造具有理想特性的新型分子。他们的研究项目旨在揭示如何用化学原理解释生物现象。

【文献链接】

https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/jacs.2c11325

编辑：蒋铃

审核：李欢欢