分享JACS上的一篇文章，题目为Modular Diazo Compound for the Bioreversible Late-Stage Modification of Proteins，文章通讯作者为麻省理工学院化学系的Ronald T. Raines教授。Raines课题组致力于功能蛋白质的设计与胞内递送。
对于功能蛋白的胞内递送，理想的蛋白质修饰应当是无痕的，即修饰蛋白进入细胞后，最终能够恢复成未修饰的功能蛋白质。目前，已有的生物可逆的蛋白质修饰策略主要针对Cys和Lys，选择较少，且无法模块化推广，对功能蛋白质的高效递送产生了一定限制。
与Cys和Lys相比，羧基（Asp & Glu）在蛋白质中的平均丰度高达10.9%，且往往具有很高的溶剂可及性，因此是潜在的蛋白偶联靶点。本文中，作者发展了一种针对羧基的生物可逆的蛋白修饰策略。为实现上述目标，作者通过三步有机合成反应，得到了一个含有三种功能的模块分子。该分子中，有一个重氮基团，以化学选择性的与蛋白质羧基之间发生酯化反应；一个吡啶基二硫键，以实现和含巯基配体之间的后期修饰反应；一个自焚性碳酸酯基团（AOCOM），以诱使酯酶对该分子模块进行水解切割，实现修饰的无痕去除。作者使用细胞色素C（Cyt c）和绿色荧光蛋白（GFP）作为模式蛋白，探究蛋白后期修饰的反应条件，并验证该修饰的生物可逆性。两个模式蛋白在分子量、表面电荷、活性Cys数量三个方面具有明显差异，故具有较好的代表性。
由于活性Cys数量的差异，作者对两模式蛋白采取了不同的修饰条件。对于Cyt c的后期修饰，作者首先将模块分子通过酯化反应连到Cyt c上，随后通过硫醇-二硫键交换反应连接配体分子；对于GFP，考虑到蛋白上的活性Cys亦可发生硫醇-二硫键交换反应，故改变反应顺序，首先将模块分子与配体分子共价偶联，随后连接到GFP蛋白上。基于优化后的反应条件，作者成功实现了两模式蛋白的后期修饰（2-6个修饰/蛋白），并证实该条件对于从小分子到大分子的配体分子，均能取得较好的修饰效率。随后，作者向上述得到的蛋白偶联物中加入猪肝酯酶或细胞裂解液，证实本文所发展的后期修饰策略能够发生酯酶依赖的可逆脱除。
基于本文发展的策略，作者向两模式蛋白上偶联细胞穿膜肽cR10，证实该后期修饰能够在含有血清的培养基下，显著提高蛋白质向哺乳动物细胞质基质的递送效率。此外，由于该修饰的生物可逆性，偶联cR10的Cyt c（Cyt c-1-cR10）在进入细胞质基质后，能够恢复成具有功能的Cyt c，最终引发细胞凋亡。综上，本篇工作发展了一种针对蛋白质侧链羧基的化学选择性、模块化、生物可逆的偶联策略，并初步证实该策略在活性功能蛋白质胞内递送中的重要应用前景。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c11325文章引用：DOI：10.1021/jacs.2c11325
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