分享一篇近期发表在ACS Cent. Sci.上的文章，题为A Non-Perturbative Molecular Grafting Strategy for Stable and Potent Therapeutic Peptide Ligands。文章的通讯作者是来自塔夫茨大学的Martin Beinborn教授及Krishna Kumar教授。

基于胰高血糖素样肽-1 (glucagon-like peptide-1, GLP1)的2型糖尿病治疗方法已经得到了长期验证。GLP1由肠道分泌产生后被加工为活性形式GLP1(7−36)，随后与其受体GLP1R结合，激活一系列调节血糖水平的信号通路。但是天然GLP1难以被直接应用于治疗。人体内普遍存在的丝氨酸蛋白酶DPP4会迅速切割其N端残基His7-Ala8，进而产生无活性的GLP1(9−36)，开发具有增强的蛋白酶抗性及更长血浆半衰期的GLP1衍生物具有突出的意义。

目前，针对增强GLP1抗蛋白酶活性这一目标已有许多尝试，例如在酶水解的关键位置His7-Ala8引入糖修饰侧链；或以非天然或非标准氨基酸替换等。尽管这些策略能够一定程度上提高稳定性，但GLP1的受体激活效力大大受损。这是由于在结合口袋中与GLP1R与GLP1的His7形成了关键的非共价相互作用，如图1ab所示。

为了达到增强抗蛋白酶活性的同时，基本保留GLP1受体激活效力的目标，作者尝试不再改变His7，而是消除DPP4识别所必需的GLP1 N端电荷，以防止被酶识别，其机理如图1d所示。由此作者设想通过三氟乙基对N端进行修饰，这一修饰在受体结合口袋中能够被容纳（图1b粉色）；但被DPP4识别时空间位阻较大，并且末端氨的pKa降低，能够削弱DPP4对其的识别。

图1. GLP1:GLP1R复合物晶体结构（a-c）及DPP4活性中心（d）

作者首先对三氟乙基修饰后获得的2-GLP1进行受体激活活性的测定。实验得到的EC₅₀值为2.8 pM，与天然GLP1相当（2.5 pM）。随后，作者通过LC-MS分析2-GLP1的抗DPP4水解稳定性，结果如图2a所示。加入DPP4孵育后，天然GLP1被切割，保留时间延长，而2-GLP1与DPP4孵育后，未观察到明显的保留时间变化。进一步地，作者对与DPP4孵育后的天然GLP1及2-GLP1进行了EC₅₀的测定，结果如图3所示。相比于天然GLP1 效价的显著降低，2-GLP1几乎没有变化。以上的结果反映出三氟乙基修饰的GLP1具有优异的抗DPP4稳定性，并同时保持了受体激活活性。

图2. GLP1及2-GLP1与DPP4孵育前后LC-MS/MS谱图

图3. GLP1及2-GLP1的浓度-效应曲线

接下来，作者通过体内葡萄糖耐量实验比较2-GLP1与天然GLP1使葡萄糖水平正常化的能力。注射GLP1的1小时后使小鼠口服葡萄糖。各时间点血糖浓度如图4所示，比较曲线趋势及曲线下面积，2-GLP1较GLP1具有延长时间的降血糖效果。

图4. 葡萄糖耐量实验曲线（a）及曲线下面积AUC（b）

综上所述，本文中作者开发了对天然GLP1的N末端进行三氟乙基修饰的策略，并通过实验验证了它功能活性的保持及对DPP4蛋白酶抗性的提高。另外，作者还通过实验验证了这一修饰可以扩展至GLP1同一家族的其他配体，例如胰高血糖素、促胰岛素多肽等。它们与GLP1具有相同的保守残基，也会被DPP4切割，反映出这一方法的多功能性。

作者：ZRC    审校：WGQ

DOI: 10.1021/acscentsci.0c01237

Link: https://dx.doi.org/10.1021/acscentsci.0c01237