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作者简介
Vishal Rai，印度科学教育与研究所博帕尔教授。研究反向：主要从事蛋白质精密工程的研究，在蛋白质偶联领域有很深的造诣。其中有名的代表为LDM偶联技术和N-Gly偶联技术。
2 研究背景 在过去的几十年里蛋白质的功能多样性及其对重要生物过程的影响激发了天然蛋白质精确工程方法的发展。蛋白质残基的微环境多样性和溶剂可及性增强了其复杂性。此外，开发一种具有反应性的残基精确偶联的模块化方法一直是一个巨大的挑战。作者在之前开发了一种技术用于标记蛋白质中低频氨基酸，称为关键物导向选择性修饰（Linchpin-Directed site-selective Modification(LDM)）。他们设计的化学结构包含两部分，如图1。其原理是利用蛋白质中的高频氨基酸如赖氨酸为关键物（linchpin）与FK1基团通过快速且可逆的生物正交反应接上蛋白质中高频的氨基酸，使得FK2基团和另一个与其临近的氨基酸残基不可逆结合，由于FK1的可逆性，因而能够实现单一标记。但他们的研究表明，随着蛋白的增加，确定适合于精确修饰单个蛋白质的LDM试剂变得极其具有挑战性。如果从低频残基中获得关键物来修改高频位点,这将是有挑战且有价值的，因此他们希望能通过低频氨基酸为关键物，标记高频氨基酸，从而实现低频向高频的跨越。他们选择以反应性高的半胱氨酸为关键物，标记临近的赖氨酸。
图1
3 文章内容 首先，作者筛选了各类与半胱氨酸巯基发生可逆反应的Michael受体，他们发现硝基烯烃化合物有着很高的转化率并可以在特定的条件下发生逆Henry反应（图2）从而使硝基烯烃变成醛基，而醛基可以先后与肼反应再被羟胺氧化接上不同的功能基团，如生物素，同位素，荧光团等。
图2
而在赖氨酸反应基团部分他们选择了反应速率相对慢且不可逆的不同酯类化合物（图3），通过筛选不同的基团，他们确定9d为测试化合物。
图3
随后他们开始测试在9d在不同肽中的选择性和竞争性，他们首先合成了各种肽链（图4），通过LC-MS检测其与9d的转化率，结果说明9d有着很好的巯基选择性，以及随后与临近赖氨酸ε-氨基实现环合和巯基发生Michael加成的可逆性，以及无痕化。
图4
在蛋白层面上，他们选择了含有1个半胱氨酸和15个赖氨酸的β-乳球蛋白A作为测试蛋白，在上述相同反应条件下与9d反应，反应结束后裂解蛋白用MS/MS确定标记的氨基酸位置，发现化合物9d只有半胱氨酸临近的单一赖氨酸被选择性修饰。此外，通过改变9d的间隔体的距离和连接位置，他们还合成了9e-9h，发现9e-9f在当量更小的情况下，反应时间更低，说明间隔体在修饰中扮演了重要的角色（图5）。
图5
此外，他们还通过计算手段得到在蛋白存在与不存在情况下化学结构中两个亲核反应C原子的距离，以及其与蛋白反应基团的距离。紧接着，他们将此技术应用到不同探针的连接上，他们尝试了同位素探针，亲和力探针和荧光探针，均取得了理想的效果（图6）。
图6
接着，他们将不同蛋白混合以模拟生物体环境，发现该结构可以实现多种蛋白中选择性偶联单一蛋白HAS，并在工程化的大肠杆菌得到证实（图7）。在抗体偶联药物（ADC）上，他们使用该技术得到的含有曲妥珠单抗和DM1偶联的药物无论是相较于单一抗体和单一细胞毒药物还是已上市的Kadcyla，对Her-2阳性细胞抑制率都更高，并且对Her-2阴性细胞毒性更小（图8）。
图7
图8
4 总结 作者开发了一种以LDM技术为基础的以半胱氨酸为关键物无痕修饰天然蛋白质中赖氨酸的方法，并合成了多种类型的探针，该方法通过靶向复杂生物分子混合物中单一蛋白质的单一赖氨酸残基来提供蛋白质选择性，提供了分析性纯的单位点探针工程蛋白质生物偶联。此外，它还提供了获得均一抗体结合物(AFC和ADC)的途径。LDM（C-K）-ADC对乳腺癌细胞表现出高度选择性的抗增殖活性。 DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-022-33772-1 点击阅读原文链接至原文
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